大白豬DQB第2外顯子SNP多態性分析

韋思婷，程一飛，舒星富

（西北民族大學 生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730030）

動物識別自己、排除非己以維持機體正常生理活動和抗疾病的能力是免疫系統的核心職能。這種能力很大程度上是由主要組織相容性復合體（Major histocompatibility complex， MHC）基因所決定的。SLA基因系統是個高度多態的系統，它的高度多態性使它成為很好的遺傳標記，且有可能作為分子標記進行輔助選擇。SLA被定位于豬7號染色體著絲粒的兩端，其基本結構與功能上存在差別，一般有三個主要類群，分別為：Ⅰ類基因、Ⅱ類基因和Ⅲ類基因。SLAⅡ類基因主要有 DRA、DRB、DQA、DQB、DOB、Dpa、TAP、LMP等，遺傳多態性最為豐富的區域是DR和DQ亞區，在控制機體的免疫應答與調節中DR亞區和DQ亞區起著重要作用，與豬的抗病能力息息相關[1]。楊文平等[2]采用 PC R-R FLP 法對山西白豬 SLA-DQB基因外顯子 2 多態性進行分析，結果表明山西白豬 SLA-DQB 外顯子 2 在 HaeⅢ酶切位點上有多態性。

1 材料

1.1 試驗材料

本試驗的試驗動物為大白豬。取仔豬耳組織 5～6 g，放入盛有 75%乙醇的EP管中，將EP管置于冰盒中帶回實驗室，在-20℃冰箱凍存備用。本試驗采用的是傳統的苯酚-氯仿抽提法以及DNA提取試劑盒對基因組DNA進行提取，TE溶解，-20℃保存備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設計 參照根據 Shia 等[3]報道的合成 SLA-DQB 基因外顯子 2 引物序列，由大連寶生物工程有限公司合成引物，擴增基因的目的片段大小約為273bp。序列為：上游引物（Primer F）：5’-CGGAATTCCCCGCAGAG GATTTCGTGTACC-3下游引物（Primer R）：5’-CCGTCGTGCCTTCCTCTAT-3’。

1.2.2 DNA混合池的構建 在所有樣品中隨機挑選大白豬的20個DNA樣，然后進行混合。

1.2.3 PCR 擴增和產物測序 PCR擴增體系總共為20μL ：去離子水7.4μL，上、下游引物各 0.4μL，DNA 模板 0.8μL，2 × Power Taq PCRMasterMix 11μL。

PCR擴增的最佳條件為：94 ℃預變性90 s;94 ℃變性 30 s，57 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，共30 個循環;72 ℃最后延伸 5 min; 4 ℃保存。擴增產物用1 %的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。在蘇州金唯智生物科技有限公司進行PCR產物混合測序。

2 結果與分析

2.1 大白豬DQB基因第2外顯子PCR擴增結果

對大白豬DQB基因第2外顯子的擴增產物用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測。結果如圖1所示，電泳檢測得到的條帶與目的片段大小一致約為273 bp，可用于直接測序。

圖 1 大白豬SLA-DQB 基因外顯子2 的PCR 產物檢測

2.2 大白豬DQB基因第2外顯子序列測定

大白豬DQB基因第2外顯子擴增產物測序結果如圖2所示，在DQB基因第2外顯子上一共有18個 SNP 位點。

圖2 大白豬 DQB基因外顯子2序列

3 討論

生物種群在長期的進化過程中某些個體會發生基因突變，產生復等位基因，導致生物體內合成不同類型的蛋白質。單核苷酸多態性(single nucleotidepolymorphisms，SNP)主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態性，形式包括單堿基的缺失、插入、轉換及顛換等。吳圣龍等[4]對3個江西省地方豬種 SLA-DQB 基因外顯子 2 的多態性進行研究，研究表明3個豬種SLA- DQB基因外顯子2多態性非常豐富。董高華等[5]采用DNA測序技術對15頭野豬的SLA-DQB基因外顯子2序列進行測定，結果表明野豬SLA-DQB外顯子2具有較豐富的核苷酸多態性。晁哲等[6]對五指山DQB基因進行研究，結果在DQB基因組中發現4處基因突變位點。本研究采用擴增產物直接測序法來對大白豬DQB 基因第2外顯子的SNP多態性進行研究，結果發現大白豬一共有18個SNP位點，表明大白豬DQB基因具有高度多態性。