兒童腸道病毒性腦炎的臨床特點及腦脊液病毒檢測結果分析

李永春，李小芹，張迎輝

作者單位：鄭州大學附屬兒童醫院、河南省兒童醫院、鄭州兒童醫院，a消化科,b腎病科,河南 鄭州 450000

腸道病毒性腦炎(enterovirus encephalitis，EVE)多表現出頭痛、發熱癥狀，夏季為其高發季節，通常發病急[1]。EVE發病與腸道病毒(enterovirus,EV)對腦實質浸潤密切相關，已知血清型超過120個，由于其發熱等癥狀不明顯，臨床易誤診或漏診，耽誤病情，增加手足口病等發生風險，嚴重時甚至導致病兒死亡。為此早期診斷EVE至關重要。目前臨床關于病毒性腦炎流行病學、病原學檢測相關報道較多[2-4]，而關于病毒性腦炎類型之一的EVE病原學相關研究較少。基于此，筆者對216例EVE病兒病例資料進行回顧性分析，總結EVE臨床特點及腦脊液病原學檢測特點，以為臨床兒童EVE診治提供依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集河南省兒童醫院2015年1月至2017年12月收治的EVE病兒216例，均符合《實用內科學》(13版)中EVE相關診斷標準，所有病兒病例資料完整，排除重度EVE、合并重癥肺炎、自身免疫性疾病、其他系統嚴重感染、資料不全等病兒。男150例(69.44%)，女66例(30.56%)；年齡范圍為6個月至～14歲，平均6歲，其中6個月至<3歲44例(20.37%)，3～<7歲76例(35.19%)，7～<14歲96例(44.44%)。本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求。病兒或近親屬對研究方案簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1標本采集 216例病兒入院后120 min內抽取其腦脊液(腰椎穿刺)2 mL、血液4 mL。常規處理后保存，若24 h內檢測則保存于4 ℃冰箱內，超過24 h檢測則保存于-70 ℃冰箱內。

1.2.2腦脊液病毒檢測 (1)EV RNA提取，按照QIAamp MinElute Virus Spin Kit(QIAGEN公司)說明書對病毒核酸提取，保存于-70 ℃冰箱中；(2)實時定量熒光聚合酶鏈式反應(Real-Time PCR)檢測：試劑盒由上海江萊生物科技有限公司提供，嚴格依據試劑盒說明書對腦脊液標本行腸道通用型檢測，若陽性再對新型腸道病毒71型(EV71)、柯薩奇病毒A組16型(CoxA16)、埃柯病毒30(ECHO30)型檢測。(3)對未分型標本來說，將其接種至RD細胞，于35 ℃、5%二氧化碳環境中培養，細胞病變超過+++則對病毒收取，保存于-70 ℃冰箱中。(4)逆轉錄PCR(RT-PCR)、VP1區序列：(1)中提取之病毒核酸為模板，PT-PCR相關試劑盒由上海信裕生物技術有限公司提供，擴增、測序引物以文獻[5]為參考；通過半巢式PCR測定VP1區序列，如引物AN32，其序列為5’-GTYTGCCA-3’，用于PT；AN224序列為5’-GCIATGYTIGGIACICAYRT-3’,用于PCR-1，擴增產婦993 bp；AN89序列為5’-CCAGCACTGACAGCAGYNGARAYNGG-3’，用于PCR-2，擴增產物37 6bp；(5)PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析。(6)核苷酸測序。

1.2.3腦脊液IgM抗體檢測 通過酶聯免疫吸附法(ELISA)測定腦脊液特異性IgM抗體，相關試劑盒由上海瓦蘭生物科技有限公司提供。酶標儀對波長450 nm處吸光度(A)測定，標本A值在1.1倍臨界值及以上判斷為陽性，在0.9倍臨界值及以下判斷為陰性，臨界值±10%內判斷為可疑，重復測定。

1.2.4資料收集 對216例EVE病兒病例資料收集整理，包括EVE癥狀、實驗室檢查[如白細胞(WBC)、C反應蛋白(CRP)、肝功能指標、心肌酶指標]、腦電圖檢查、病原學檢測、治療、預后等。

1.3 統計學方法應用SPSS20.0統計軟件處理數據。計數資料以率表示，行χ2檢驗。多組間比較檢驗水準α=0.05，,兩兩比較α=0.017。

2 結果

2.1 臨床特點

2.1.1臨床癥狀 216例病兒中出現發熱癥狀150例(其中高熱50例，中熱78例，低熱22例)，頭痛139例，嘔吐162例，表現出抽搐2例，有可疑腦膜刺激征或病理征3例，少數表現出腹痛、腹瀉、咳嗽癥狀，大部分無明顯流涕、流淚等癥狀。均無意識障礙、呼吸困難等嚴重癥狀發生。不同年齡段病兒主要癥狀見表1。

表1 不同年齡段EVE病兒主要癥狀/例(%)

注：“—”表示因病兒主訴不清未統計;EVE為腸道病毒性腦炎

2.1.2發病時間段 3—5月30例(13.89%)，6—8月85例(39.35%)，9—11月68例(31.48%)，1、2、12月33例(15.28%)。

2.1.3相關檢查 WBC總數超過10×109/L者149例(68.98%)，WBC總數下降者2例(0.92%)；CRP上升者125例(57.87%)；肝功能異常者40例(18.52%)，均未發生黃疸；心肌酶檢查異常者172例(79.63%)。所有病兒均接受腦電圖檢查，顯示輕中度異常47例(21.76%)；顱腦CT平掃者180例，均未發現顯著異常。

2.2 腦脊液病原學檢測

2.2.1腦脊液EV檢測結果 216份腦脊液標本EV通用核酸檢測陽性120份，其中ECHO30核酸陽性95份(79.17%，95/120)，CoxA16核酸陽性5份(4.17%，5/120)，EV71核酸陽性5份(4.17%，5/120)，未分型15份(12.50%，15/120)。不同年齡段病兒腦脊液EV通用核酸陽性檢出率比較差異有統計學意義(χ2=25.38，P<0.05)，6個月至<3歲與3～<7歲之間EV通用核酸陽性率比較差異無統計學意義(χ2=3.01，P>0.017)，6個月至<3歲與7～<14歲、3～<7歲與7～<14歲之間比較差異有統計學意義(χ2=21.34、12.35，P均<0.017)，見表2。同時不同發病季節病兒腦脊液EV通用核酸陽性檢出率比較差異有統計學意義(χ2=111.37，P<0.05)，3—5月與6—8月、3—5月與9—11月EV通用核酸陽性率比較差異有統計學意義(χ2=58.72、48.87，P<0.017)，6—8月與9—11月之間比較差異無統計學意義(χ2=0.28，P>0.017)，1、2、12月與6—8月、1、2、12月與9—11月之間比較差異有統計學意義(χ2=62.30、52.01，P<0.017)，見表3。

表2 不同年齡段EVE病兒腦脊液EV通用核酸陽性情況

表3 不同發病時間段EVE病兒腦脊液EV通用核酸陽性情況

2.2.2腦脊液IgM抗體檢測結果 216例病兒中腦脊液特異性IgM抗體陽性95例。不同年齡段病兒腦脊液特異性IgM抗體陽性檢出率比較差異有統計學意義(χ2=16.91，P<0.05)；6個月至<3歲與3～<7歲、6個月至<3歲與7～<14歲之間IgM抗體陽性率比較差異有統計學意義((χ2=5.50、16.80，均P<0.017)，3～<7歲與7～<14歲之間比較差異無統計學意義(χ2=3.95，P=0.047)，見表4。不同發病時間段病兒腦脊液特異性IgM抗體陽性檢出率比較差異有統計學意義(χ2=69.83，P<0.05)；3—5月與6—8月、3—5月與9—11月IgM抗體陽性率比較差異有統計學意義(χ2=34.70、32.43，P<0.017)，6—8月與9—11月之間比較差異無統計學意義(χ2=0.01，P>0.017)，1、2、12月與6—8月、1、2、12月與9—11月之間比較差異有統計學意義(χ2=37.35、34.89，P<0.017)，見表5。

表4 不同年齡段EVE病兒腦脊液特異性IgM抗體陽性情況

表5 不同發病時間段EVE病兒腦脊液特異性IgM抗體陽性情況

2.3 治療與預后所有病兒入院后接受抗病毒、20%甘露醇靜注、支持等綜合治療，且根據相關檢查結果對癥處理，如WBC、CRP顯著上升者給予抗生素處理，高熱者給予物理降溫等處理。所有病兒經綜合治療后好轉，均治愈出院。

3 討論

于盼輝等[6]調查顯示病毒性腦炎病毒陽性檢出率41.50%，其中EV占87.88%。但EV與其他病毒引發病毒性腦炎病兒在性別、臨床表現、腦電圖、MRI檢查方面均無明顯差異。田茂強等[7]調查發現兒童病毒性腦炎病原學方面，EV占72.00%。根據病毒性腦炎病原學流行特點，我們選擇EVE為研究對象，探討其EVE臨床特點及腦脊液病毒檢測特點。

3.1 EVE兒童臨床特點本研究顯示EVE主要表現發熱、頭痛、嘔吐等癥狀，與病毒性腦炎癥狀基本類似[8]。僅3例表現出可疑腦膜刺激征或病理征，抽搐2例。進一步觀察不同年齡病兒臨床癥狀，發現3～<7歲病兒發熱癥狀比率最高，其次是嘔吐，第三是頭痛；<7～<14歲病兒頭痛癥狀比率最高，其次是嘔吐，第三是發熱。同時2例抽搐均發生于<3歲病兒。可見不同年齡段EVE臨床癥狀存在一定的不同，但整體上無明顯差異。發病時間段方面，我們發現6—11月發生153例(70.83%)，特別是6—8月，EVE發生率占39.35%。可見EVE好發于夏秋季，特別是夏季。這是因為EV在黏液、唾液、排泄物中分布，經由接觸傳播，同時EV有耐熱、耐酸性，因此夏季EVE發病率高[9]。相關檢查指標方面，WBC、CRP在臨床上常用于感染判斷，本研究顯示WBC總數>10×109/L占68.98%，CRP升高占57.87%，與EVE病兒表現出發熱癥狀保持一致。還發現肝功能異常率18.52%，心肌酶異常占79.63%。提示EVE可能引發心肌炎等相關疾病，需高度重視EVE。本研究發現EVE伴輕中度腦電圖異常，但通常不存在腦實質改變征象。此外，目前臨床尚無特異方案干預兒童EVE，病兒雖表現出發熱、嘔吐等癥狀，但及時給予抗病毒等綜合治療后，病兒預后通常較好。

3.2 EVE兒童腦脊液病毒檢測EV為腦炎發生常見病原體之一，主要包括ECHO病毒、COX病毒、新型腸道病毒等，其中ECHO病毒全球流行，是EVE發生的主要腸道病毒；CoxA16、EV71感染引發腦炎在高原地區等也有所報道，EV全球各地均有所分布，易引發流行性疾病，對機體多系統可以影響，臨床癥狀多樣，嚴重時甚至威脅病人性命，且EV引發疾病以兒童多見。目前臨床常通過癥狀、輔助檢查、腦脊液病原學檢測等綜合判斷病毒性腦炎。其中腦脊液病原學檢測有ELISA、病毒核酸檢測等。Real-Time PCR為病毒核酸檢測重要手段，對微量特異性核酸序列可快速檢測，且準確度高[10]。本研究通過Real-Time PCR檢測EV核酸，結果顯示腦脊液EV通用核酸檢測陽性率55.56%，其中ECHO30核酸陽性最多，占79.17%，與相關報道[11]結果相符。ECHO30感染會導致兒童無菌性腦膜炎流行[12-13]。同時本研究CoxA16與EV71檢出率均為4.17%，而未分型檢出率12.50%。可見EV類型多樣，其中以ECHO30最為常見。

ELISA具有操作簡單、特異度強等特點，我們通過ELISA法測定腦脊液特異性IgM抗體，結果顯示IgM抗體陽性率43.98%，比EV通用核酸檢測陽性率低，這可能與抗體產生與病兒免疫功能、病程相關，有個體差異性有關[14]。盧囡囡等[15]研究顯示5～10歲兒童EVE發生率較高，占EV通用核酸陽性的81.82%。本研究EVE病兒年齡7～<14歲96例，<3歲44例，但<3歲病兒腦脊液EV通用核酸陽性檢出率最高，與盧囡囡等[15]研究結果不相符，這可能與不同地區高度、氣候條件、環境等不同有關。本研究還顯示腦脊液EV通用核酸陽性檢出率、特異性IgM抗體陽性檢出率與EVE病兒年齡、發病時間段有關，6個月至<3歲病兒示腦脊液EV通用核酸陽性檢出率、特異性IgM抗體陽性檢出率最高，這可能與<3歲病兒機體免疫系統發育不成熟、機體抵抗能力差等有關，同時也可反映出腦脊液EV通用核酸陽性檢出率與特異性IgM抗體陽性檢出率在年齡分布、發病時間段上有一致性，這與EVE發病特點(好發于夏季等)有關。但<3歲腦脊液EV通用核酸陽性、特異性IgM抗體陽性構成比相比其他年齡段無顯著差異，這與本研究病例選擇有關。

綜上，兒童EVE主要表現出發熱、頭痛、嘔吐等癥狀，以夏、秋季為發病高峰季節；ECHO30為EVE腦脊液病毒主要類型，特異性IgM抗體檢出率較高。由于目前關于EVE流行病學調查較少，且本研究為回顧性分析，樣本例數較少，關于EVE流行病學、病原學研究需日后通過大樣本進一步分析。