右旋美托咪啶對驚厥性癲癇持續狀態大鼠認知功能和神經炎癥的影響

韓耀國，張濤，葉明榮，陳剛，姚玉龍，許開亮，孫躍喜，雷鳴

作者單位：上海中醫藥大學附屬第七人民醫院重癥醫學科，上海 200137

癲癇持續狀態(status epilepticus,SE)是一種常見的神經系統疾病，可分為驚厥性(convulsive status epilepticus,CSE)和非驚厥性(nonconvulsive status epilepticus,NSE)。CSE表現為有規則的胳膊和腿的交替收縮和伸展。CSE可導致海馬神經元的喪失[1]。由于嚴重的腦損傷，一些CSE病人表現出認知功能障礙、抑郁、焦慮和其他精神癥狀，嚴重降低了病人的生活質量[2]。CSE也可以誘導神經炎癥反應并參與其發病機制[3]。因此，抗炎治療已經顯示出預防和治療癲癇發作的希望[4]。

右旋美托咪啶(dexmedetomidine,DEX)是一種有效的α2-腎上腺素能(a2A)特異性激動劑，具有鎮靜和鎮痛作用，維持血流動力學穩定，減少麻醉相關并發癥的發生[5]。DEX具有抗炎癥特性，從而促進腦缺血后的神經保護作用[6]。DEX的神經炎癥抑制作用是通過激活α7-煙堿乙酰膽堿受體(α7-nAChR)誘導的[7]。DEX改善認知功能的一個重要作用部位是海馬，一個對于學習和記憶功能至關重要的腦區[8]。然而，目前DEX對CSE 的抗驚厥作用的機制尚未完全闡明。

在本研究中，我們自2017年1—7月建立了CSE大鼠模型，并用DEX進行預處理。觀察大鼠的認知功能，癲癇發作嚴重程度和電生理指標。測量海馬組織膽堿能抗炎通路的相關蛋白，以闡明DEX的機制，并尋找CSE病人的治療靶點。

1 材料和方法

1.1 動物選擇和分組研究對象為成年雄性Sprague-Dawley大鼠，年齡10周，體質量(200±20)g，由SLRC實驗動物中心(中國上海)提供，飼養于20～24 ℃和40%～70%的濕度條件下。應用隨機數字表法將動物分為對照組，CSE組和DEX組，每組30只。DEX組大鼠腹膜內注射右旋美托咪啶(100 μg/kg，1次/天，恒瑞制藥有限公司，批號130621)。DEX給藥總時間為8 d，包括CSE誘導前3 d，CSE誘導后5 d。動物研究符合一般動物實驗倫理學原則。本研究中對于大鼠的處理符合動物倫理學相關標準。

1.2 建立CSE模型每只大鼠腹膜內注射氯化鋰(3 mEq/kg)，18～20 h后腹膜內注射毛果蕓香堿(30 mg/kg)。如果沒有發生驚厥，則另外注射毛果蕓香堿(約為原始劑量的約1/4)。根據Simialowski方法評估大鼠的驚厥，并將其分為0～5級。具有IV和V驚厥水平的大鼠表示廣泛性抽搐，用以本研究的實驗。對照組大鼠用等體積的0.9%鹽水替代氯化鋰和毛果蕓香堿。

1.3 癲癇嚴重度測量CSE誘導后立即監測大鼠的癲癇發作活動120 min，用修訂版Racine評分(MRS)評估癲癇發作嚴重程度：1～2級：面部陣攣和頭部點頭；3級：單側前肢陣攣；4級：豎起和雙側前肢陣攣；5級：豎起和倒下；6級：抽搐發作；7級：后肢伸展。

1.4 Morris水迷宮試驗應用Morris水迷宮試驗測量大鼠CSE誘導后1、3和5 d時的空間記憶能力。一個透明平臺放置在水迷宮池四個象限中的1/2個半徑內，水面高于平臺頂部1 cm。將大鼠放在水迷宮池中遠離平臺的象限，并引導其找到并爬上平臺，并將該持續時間記錄為逃避潛伏期(最大60 s)。然后將平臺從池中取出，將大鼠置于前一測試對面象限的水中。觀察游泳路徑60 s，并將大鼠越過原來平臺位置的次數記錄為穿越平臺次數。

1.5 LTP的電生理記錄CSE誘導后第5天，用1.2%異氟烷麻醉大鼠，提取大腦，置于含氧切片液(0～4 ℃)中1～2 min。制備海馬切片，并在35 ℃下在記錄溶液中放置30～45 min，連續灌注氧合記錄溶液(1.5 mL/min，35 ℃)。將單極記錄電極插入CA1錐體細胞的海馬區，應用高頻刺激(high frequency stimulation,HFS;10列，400 Hz)誘導，在HFS之后每5 min記錄一次細胞外群體峰電位振幅(population spike amplitude,PSA)，持續120 min，作為場興奮性突觸后電位(field excitatory postsynaptic potential,fEPSP)。

1.6 免疫組織化學檢測海馬α7-nAChR表達CSE誘導后第5天，用1.2%異氟烷麻醉大鼠，取海馬組織用4%多聚甲醛固定、脫水、石蠟包埋，以制備連續切片(5 μm厚)。切片與兔抗小鼠α7-nAChR(1∶100)孵育4 ℃過夜，PBS洗2次后與生物素化 HRP-IgG(1∶100，第二抗體)在室溫下孵育2 h。切片用二氨基聯苯胺(DAB)著色，并用蘇木精復染。在Olympus BX51顯微鏡(日本奧林巴斯公司)下觀察并計數α7-nAChR陽性神經元(褐色細胞)，然后將5個視野的總計數轉化為細胞密度(細胞/HP)。

1.7 海馬細胞因子分析CSE誘導后1、3、5 d大鼠麻醉，取海馬組織制備勻漿。通過4 ℃離心10 000g×10 min分離上清液，使用酶聯免疫吸附法(ELISA)試劑盒測定IL-1β、TNF-α、S-100β和BDNF水平。通過酶標儀(Ricso RK201，深圳瑞科索科技有限公司)測量450 nm處的光密度(OD)獲得數據。

2 結果

2.1 DEX對CSE大鼠認知、癲癇嚴重程度和LTP的影響Morris水迷宮試驗顯示：與CSE組相比，DEX組在3 d和5 d的逃避潛伏期顯著縮短(P<0.05)(圖1A)，穿越平臺次數顯著增加(P<0.05)(圖1B)。表明DEX能顯示改善CSE大鼠的空間記憶能力。

我們通過評估CSE誘導后120 min的癲癇指數，探索DEX是否影響CSE大鼠的癲癇發作嚴重程度。與CSE大鼠相比，DEX大鼠在誘導后40、60、80、100和120 min時癲癇發作明顯降低(P<0.05)(圖1C)。這表明DEX在CSE大鼠中顯示了抗驚厥作用。

為了研究DEX對突觸傳遞的影響，于CSE誘導后第5天制備海馬切片，應用高頻刺激(HFS)測量LTP。HFS誘導5 min后LTP急劇增加至基線的2.8倍左右，然后緩慢下降。與對照組比較，CSE大鼠fEPSP斜率較低。DEX能增加CSE大鼠大多數時間點的fEPSP斜率(圖1D)。這表明DEX能增強CSE大鼠HFS后的LTP。和CSE組相比，DEX顯著升高HFS誘導后30、60和90 min的fEPSPS 振幅(P<0.05)(圖1E)。

注：fEPSP幅度歸一化為相對于基線fEPSP的比值。與對照組相比，aP<0.05；與CSE組相比，bP<0.05圖1 DEX對CSE大鼠認知功能障礙、發作嚴重程度和LTP的影響：與CSE大鼠相比，DEX預處理(100 μg/kg，1次/天)顯著降低逃避潛伏期時間(A)，增加平臺交叉數在癲癇發作后比較CSE組和DEX組大鼠的癲癇發作評分，每20分鐘記錄一次評分大鼠HFS前后LTP誘導的時程和程度。(E)HFS誘導后30、60和90 min的平均fEPSP幅度

注：與CSE組相比，bP<0.05圖2 DEX增加CSE大鼠海馬中α7-nAChR陽性神經元表達：免疫組織化學顯示CSE誘導后第5天對照組(A)、CSE組(B)和DEX組大鼠海馬的α7-nAChR陽性神經元(C)(×200)。定量數據顯示，DEX顯著增加α7-nAChR陽性神經元的細胞密度

注：相對于CSE組，aP<0.05圖3 DEX對CSE大鼠海馬組織細胞因子水平的影響：在CSE誘導后第1、3和5天，ELISA測量大鼠海馬組織勻漿IL-1β、TNF-α、S-100β和BDNF蛋白水平。DEX降低海馬IL-1β(A)，TNF-α(B)，S-100β(C)水平，增加BDNF(D)水平

2.2 DEX對CSE大鼠海馬中α7-nAChR陽性神經元的影響免疫組化顯示數量與對照組相比，CSE大鼠海馬組織α7-nAChR陽性神經元數目明顯低于對照組(P<0.05)。與CSE大鼠相比，DEX組的α7-nAChR陽性神經元數量顯著增多(P<0.05)(圖2)。這表明DEX可以增加CSE大鼠海馬中的α7-nAChR表達。

2.3 DEX對CSE大鼠海馬細胞因子水平的影響

和CSE組相比，DEX顯著降低CSE大鼠海馬IL-1β、TNF-α和S-100β水平(P<0.05)(圖3A，3B，3C)，顯著升高CSE大鼠海馬BDNF水平(P<0.05)(圖3D)。這表明DEX可以抑制海馬組織生成促炎癥細胞因子，減少腦損傷，并改善神經再生的微環境。

2.4 α7-nAChR參與DEX對CSE大鼠的抗癲癇作用為了探討α7-nAChR在DEX對CSE大鼠抗驚厥中的作用，我們用DEX，尼古丁(0.5 mg/kg，)皮下注射或DEX +α-BGT(1.0 μg/kg)靜脈注射預處理CSE大鼠。與CSE大鼠相比，DEX和尼古丁預處理組均顯著降低CSE誘導后120 min的癲癇發作評分，DEX降低癲癇發作評分的作用能被α-BGT減弱(P<0.05)。此外，DEX增加LTP的作用可以被α-BGT預處理逆轉(P<0.05)(圖4)。

注：相對于CSE組，aP<0.05;相對于DEX組，bP<0.05圖4 DEX對CSE大鼠的作用依賴于α7-nAChR:CSE大鼠用DEX、尼古丁、DEX+α-BGT(1.0 μg/kg)靜脈注射預處理。(A)與CSE大鼠相比，DEX和尼古丁顯著降低了癲癇發作。α-BGT預處理減弱DEX的抗癲癇作用。(B)DEX和尼古丁顯著增加CSE大鼠的LTP。DEX對LTP的作用可以通過α-BGT預處理逆轉

3 討論

在本研究中，我們應用腹膜內注射氯化鋰和毛果蕓香堿建立CES大鼠模型，并探索了右旋美托咪啶(DEX)的抗癲癇作用和機制。研究結果表明，DEX改善了CSE大鼠的認知功能，減輕CSE大鼠癲癇發作，增強LTP，延長其持續時間，表明DEX具有抗驚厥作用。DEX顯著增加CSE大鼠海馬中α7-nAChR陽性神經元數量，降低海馬組織IL-1β、TNF-α、S-100β蛋白水平，升高BDNF水平。此外，DEX對癲癇嚴重程度和LTP的作用依賴于α7-nAChR途徑，因為尼古丁(α7-nAChR激活劑)預處理具有和DEX類似的作用，α-BGT(α7-nAChR抑制劑)可以逆轉DEX的作用。

認知缺陷是CSE的常見癥狀，也加重了癲癇活動[2]。這表明能改善認知功能的藥物也可能減輕癲癇發作嚴重程度。DEX降低了手術或ICU期間病人認知功能障礙的風險[9]。我們的結果顯示了DEX在癲癇發作動物模型中的認知改善功能。DEX預處理也顯示了抗驚厥作用，表現為CSE大鼠癲癇發作評分下降。DEX能提高麻醉劑利多卡因的中毒劑量閾值，從而延遲了利多卡因誘發的驚厥的發生[10]。在我們的CSE模型中，DEX也可能增強了毛果蕓香堿的中毒劑量閾值。DEX可能是CSE的潛在治療劑。

長時程增強增強(LTP)是基于近期活動的突觸持續強化，從而在兩個神經元之間產生長期增強的信號傳輸，其主要表現為fEPSP的增強。海馬中LTP的抑制可能會損害學習和記憶能力[11]。在本研究中也觀察到，由氯化鋰和毛果蕓香堿誘導的癲癇大鼠海馬切片中的LTP誘導減少[12]，這種降低的LTP可能與認知功能障礙和發作嚴重程度相關。DEX能逆轉CSE誘導的海馬LTP下降，這表明其具有神經保護和抗癲癇效應，如其他報道所示[13]。我們的結果與其他報道相反，DEX抑制了麻醉嚙齒動物的海馬LTP，從而誘導鎮靜作用[14-15]。這種差異可能在于海馬組織的種類。在正常海馬切片中，低濃度DEX灌注(1和10 μmol/L)下LTP無變化，但在較高濃度DEX灌注(100 μmol/L)下LTP顯著降低。然而，在經受氧-葡萄糖剝奪(OGD)的海馬切片中的LTP降低，而DEX能促進LTP的恢復[16]。這表明DEX可以抑制正常的海馬LTP(麻醉的嚙齒動物)，并增強患病動物的海馬LTP，如OGD和CSE大鼠所見。這種差異可能在于DEX在正常和患病海馬中所激活的不同信號傳導途徑。

DEX增加CSE大鼠海馬中α7-nAChR蛋白的表達，這表明DEX可激活膽堿能抗炎通路，如脛骨骨折大鼠[7]和敗血癥小鼠[17]所支持的。在毛果蕓香堿誘導的癲癇持續狀態小鼠中，海馬組織的乙酰膽堿酯酶(AChE)表達上調，促進癲癇發生過程[18]。上調的AChE能導致乙酰膽堿(ACh)水平降低和膽堿能通路減弱。相反，α7-nAChR激動劑改善了學習和記憶能力，減輕了小鼠和大鼠的癲癇發作[19]。α7-nAChR的活化也抑制炎癥細胞因子的表達和釋放，這支持我們的結果，如DEX降低 CSE大鼠的海馬組織IL-1β和TNF-α水平。IL-1β和TNF-α常見的促炎癥細胞因子，癲癇發作后L-1β和TNF-α在海馬組織的表達持續上調，提示癲癇發作可能誘發炎癥反應[20]。膽堿能途徑也可能對LTP產生積極影響。α7-nAChRs基因敲除(KO)小鼠在海馬CA3-CA1突觸中表現出受損的LTP，而IL-1β降低了海馬CA3-CA1的突觸可塑性和LTP[22]。這解釋了為什么在我們的結果中DEX也能增強CSE大鼠的LTP。此外，在我們的研究中，DEX在CSE誘導前3天施用，而其它文獻中DEX給藥時間在麻醉嚙齒動物進行LTP測量之前20 min[14-15]。這可能給予足夠的時間上調海馬α7-nAChRs表達，從而增加對LTP誘導的敏感性。在我們的研究中，DEX還降低了CSE大鼠海馬S-100β水平，升高了BDNF水平。S-100β是腦中酸性Ca2+結合蛋白，腦損傷后可釋放到體液中。與健康受試者相比，癲癇病人血清和腦脊液S-100β蛋白水平較高，表明癲癇腦損傷[23]。BDNF是涉及神經元存活和突觸可塑性的生長因子，在學習和記憶功能中起關鍵作用。大鼠癲癇發作腦損傷能降低血清BDNF水平[24]。因此，我們的研究結果表明，DEX可以減輕神經元損傷，促進CSE大鼠神經再生。

總之，DEX可以顯著改善CSE大鼠的認知功能障礙，發作嚴重程度和LTP。DEX激活膽堿能抗炎癥通路，抑制炎性細胞因子釋放并顯示出神經保護作用。DEX抑制癲癇發作嚴重程度和增強LTP依賴于α7-nAChR。我們的研究結果表明DEX是一種CSE和其他癲癇發作的潛在治療藥物。