遮陰對抹茶茶園土壤微生物特性及土壤酶活性的影響

王國夫，孫小紅，方逸，周瑾，沈倩婷，項俊蕾，金仙玲，羅杏韻

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遮陰對抹茶茶園土壤微生物特性及土壤酶活性的影響

王國夫，孫小紅*，方逸，周瑾，沈倩婷，項俊蕾，金仙玲，羅杏韻

紹興文理學院元培學院，浙江 紹興 312000

分析了遮陰對浙江省抹茶主產區茶園土壤微生物特征以及土壤養分和酶活性變化情況。結果表明，抹茶茶園遮陰后0~20?cm土層有機質、全氮、水解氮、全磷、有效磷和有效鉀含量較未遮陰茶園增加，達到顯著水平。遮陰茶園土壤的有機質含量達49.81?g·kg-1，顯著高于未遮陰茶園土壤32.50?g·kg-1（<0.05）。茶園遮陰后可以顯著提升土壤脲酶、蔗糖酶、土壤蛋白酶、酸性磷酸酶和堿性磷酸酶的活性（<0.05）。遮陰茶園細菌、真菌等多樣性指數和基因型豐富度也高于未遮陰茶園。遮陰可以提升抹茶茶園土壤營養元素含量以及與土壤養分轉化密切相關的幾類酶的活性，增加表層土壤微生物的數量和活性，有利于受損茶園土壤生態系統的恢復和重建，全面提升土壤質量。

抹茶茶園；遮陰；土壤微生物；土壤酶；土壤營養

抹茶是以采摘遮陰覆蓋下茶樹的鮮嫩芽葉為茶原料，經蒸青、烘干兩道工序，再用茶臼磨成而制得翠綠色細粉末茶[1-2]。從飲茶變為食茶，改變茶葉食用方式，極大地拓展了茶葉的應用領域[3-4]。

抹茶生產有其特殊性。《中國抹茶國家標準》（GB/T 34778—2017）的定義是：“采用覆蓋栽培的茶樹鮮葉經蒸汽（或熱風）殺青后、干燥制成的葉片為原料，經研磨工藝加工而成的微粉狀茶產品”。因此，在抹茶茶葉的生長期采用遮陰覆蓋栽培技術，為現代抹茶生產管理的必須步驟。抹茶特殊的香氣“覆蓋香”便是通過這種栽培方式而獲得的[3]。

為了改善茶園的生態環境，遮陰成為茶園管理中一項重要農藝措施。前期研究發現遮陰覆蓋不但可以增加茶園空氣濕度，還有助于降低土壤容重，增加土壤孔隙度，提高土壤含水量及養分元素[5-7]，可優化茶葉品質。這些研究多集中在遮陰覆蓋對茶園生態環境和茶葉品質的影響[8]，而對土壤微生物群落以及土壤酶活性影響的研究較少。土壤微生物多樣性與生態系統抵御外界干擾的能力密切相關。茶園土壤微生物是茶園生態系統的重要組成部分，土壤微生物作為具有決定性影響的組成部分，參與并推動著土壤養分轉化。同時土壤酶活以及土壤微生物特征也會影響茶葉產量和品質[9-11]。目前有關抹茶的研究多集中在抹茶生產、加工、營養、覆蓋方式等方面[12-13]，關于抹茶生產中遮陰對其土壤微生物及土壤酶活性研究較少。基于此，本研究以全國最大抹茶生產基地為代表，研究遮陰對抹茶茶園土壤養分和微生物群落特征的影響，為現代抹茶茶園土壤管理提供參考，以實現茶園的可持續發展。

1 材料與方法

1.1 采樣地基本情況

采樣位點選取浙江省紹興市富盛鎮茶園（120°69′E，29°90′N），該區域目前有國內最大的抹茶種植和加工企業。該區屬亞熱帶季風氣候，溫暖濕潤，四季分明，年平均氣溫16.2~16.5℃，降水量為1?301~1?465?mm。試驗地為緩坡平地，土壤主要為紅壤。茶樹品種為藪北，樹齡15?a。采樣區為長方形地塊，茶樹行距為1.5?m，試驗設置2個處理：遮陰和不遮陰，每個處理3次重復。遮蔭棚高1.8?m、寬10?m、長20?m，3個重復小區之間設置2?m寬的隔離行。覆蓋方式都為架棚覆蓋：以水泥柱為材料，在茶園里搭建棚架，棚頂離地面1.8?m高。在谷雨前20?d左右，使用黑色遮陰網，覆蓋在棚面上，覆蓋40?d后進行采摘加工制作成抹茶，其后采摘茶葉作為普通茶葉銷售，秋季（10月左右）去掉遮陰網。試驗于2016年4月開始，連續遮陰處理3年。茶園土壤每年施一次有機肥，商品有機肥用量一般為3?000?kg·hm-2，每年春秋各施復合肥一次，用量為450?kg·hm-2（N∶P2O5∶K2O=15∶15∶15）。

1.2 土壤樣品采集

土壤樣品采集時間為2018年5月底。根據采樣位點的地形條件，在10?m×20?m區域內采用5點混合取樣法，每個采樣點沿著茶樹樹冠邊緣垂直投影取樣，清除地表的枯枝落葉，用土壤采樣器分別采集0~20?cm土層樣品，將采集好的樣品裝入無菌封口袋，放入冰盒，帶回實驗室，清除植物根系、大石塊等可見雜質后，將每個樣品分成3份，其中1份土樣放于4℃保存備用，1份放在超低溫冰箱保存用于高通量測序分析微生物群落結構多樣性，1份土樣放室內自然風干后過2?mm篩，用來測定土壤酶活和土壤理化特性。

1.3 試驗方法

1.3.1 茶園土壤理化性質的測定

茶園土壤pH的測定采用電位法；土壤有機質的測定采用灼燒法；全氮采用開氏定氮法測定；堿解氮采用堿解-擴散法；土壤速效磷使用碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗比色法；全磷采用氫氧化鈉堿熔-鉬銻抗比色法測定；有效鉀采用火焰原子吸收分光光度計法。

1.3.2 茶園土壤酶活性測定

茶園土壤蔗糖酶活性采用3,5-二硝基水楊酸比色法測定，用1?g土壤在37℃下24?h內水解產生葡萄糖的毫克數表示；土壤脲酶活性采用靛酚藍比色法測定，用1?g土壤在37℃下24?h內水解產生氨氮的毫克數表示；土壤磷酸酶活性采用磷酸苯二鈉比色法測定，用1?g土壤在37℃下24?h內苯酚的釋放量來表示。蛋白酶采用比色法，以24?h后1?g土壤中甘氨酸的微克數表示。

1.3.3 土壤細菌DNA的PCR擴增及DGGE

采用PCR-DGGE法。按照土壤提取試劑盒提取總DNA，并對提取的DNA進行瓊脂糖凝膠電泳分析。細菌16?S rDNA V3片段的擴增采用通用引物對R518/F341，引物序列見表1。擴增條件為94℃，預變性2?min；98℃變性10?s，58℃退火15?s，68℃延伸1?min，25個循環。細菌基因組PCR擴增產物經QIAquick Gel Extraction Kit（Qiagen貨號：28704）進行純化，并對PCR擴增產物進行電泳分離。將PCR產物加入到10%的聚丙烯酰胺凝膠中，采用40%~60%凝膠變性梯度。電泳條件：緩沖液1×TAE，溫度60℃，電壓100?V，時間20?h。電泳結束后，采用硝酸銀快速銀染。用凝膠成像分析系統分析染色后的凝膠，觀察電泳條帶并拍照。選擇條帶切膠回收、連接pEasy-T載體，將其轉化大腸桿菌DH5感受態細胞后，送TaKaRa公司進行測序。將有效序列在NCBI的Blast程序進行比對，找出與目的片段相似度高的菌種[14-15]。

1.3.4 土壤真菌DNA的PCR擴增及DGGE

真菌18?S rDNA擴增采用引物NS1/GC-Fungi。引物序列見表1。PCR反應體系、反應條件以及DGGE條件見參考文獻[16]。DGGE條帶的切膠、回收和克隆方法參考文獻[17]，將篩選到的陽性克隆送至TaKaRa公司進行測序。使用Blast將序列與GenBank中的序列進行同源性比較，以找出與靶片段具有高度相似性的菌種[18]。

1.4 數據統計分析

數據分析采用Excel 2010和SPSS 19.0統計軟件。處理間的差異顯著性采用Duncan法進行單因素多重比較法（<0.05）。采用Quantity One軟件進行DGGE條帶的數字化分析以計算樣品中可檢測到的DGGE條帶數，根據條帶的相對位置和相對強度計算Shannon-Wiener指數（）、基因型豐富度（）和均勻度指數（E）來評價微生物的多樣性[14]，其公式為：

式中為某一條帶的強度與同泳道中所有條帶總強度的比值，為基因型豐富度，即DGGE圖譜中每一個樣本所含的條帶數目。

2 結果與分析

2.1 抹茶茶園土壤化學性質及土壤酶活性

遮陰茶園和未遮陰茶園土壤性質見表2。遮陰和未遮陰茶園土壤pH分別為4.33和3.95，均小于4.5，有酸化傾向。結合茶葉產地環境技術條件（NY/T 853—2004）和優質、高效、高產茶園的土壤營養診斷指標[19]，未遮陰茶園土壤全氮小于基準1?g·kg-1，遮陰茶園營養指標達到高產優質茶園的要求。遮陰后的茶園土壤有機質、全磷、水解氮、全氮、有效磷和有效鉀顯著大于未遮陰茶園。與標準相比，所有樣地有機質含量都非常高，這與茶園每年施用大量有機肥有關。遮陰茶園土壤的有機質質量分數高達49.81?g·kg-1，顯著高于未遮陰茶園土壤的32.50?g·kg-1。制作抹茶的鮮葉覆蓋40?d后采摘，用于抹茶加工的茶鮮葉只采摘一季，但遮陰網保持到秋季才去除，整個遮陰時間維持6個月左右。結果表明相對裸露地面，長時間遮陰可以增強土壤保肥能力。

表1 試驗中所用的引物

表2 抹茶茶園土壤基本化學性質

注：同列不同字母表示差異顯著（＜0.05）。下同

Note: Different letters in the same column indicated significant difference at 0.05 level. The same as follow

表3 抹茶茶園土壤酶活性

土壤酶是表征土壤物質、能量代謝和土壤質量水平的一個重要生物指標。茶葉是葉用型經濟作物，氮素營養狀況至關重要，研究土壤脲酶和蛋白酶活性能夠了解土壤氮轉化能力和有效利用度。從表3可以看出，抹茶茶園土壤酶活性和土壤養分變化趨勢基本相同，抹茶茶園遮陰后，脲酶、蛋白酶、蔗糖酶、磷酸酶等活性均顯著高于對照（＜0.05）。其中蔗糖酶活性是未遮陰茶園的3倍以上。蔗糖酶是評價土壤中物質轉化強度的酶類，此結果說明遮陰抹茶茶園土壤肥力相對較高。

對比表2和表3可知，各種酶活性基本與土壤pH變化趨勢一致，pH大的酶活性也增大，土壤偏酸，各種酶活性相對偏低。遮陰茶園各類磷酸酶活性增加，這將加速磷酸酶催化土壤有機磷化合物的水解，生成更多植物可利用的無機態磷，從而增強土壤磷的供應能力。

2.2 抹茶茶園土壤細菌群落多樣性分析

使用細菌16?S rDNA片段通過DGGE被分離為若干條帶。根據茶園土壤微生物DGGE圖譜中電泳條帶的數目和亮度進行數字化處理，結果如圖1-A所示。結果表明遮陰和未遮陰樣地的DGGE圖譜中有許多共同條帶，同時還存在一些不能被分辨的條帶。其中遮陰土樣條帶數基本高于非遮陰土樣，B6、B7、B8和B11條帶在遮陰茶園中亮度較高。對每個樣品中的細菌多樣性指數、豐度和均勻度等指標進行分析[20]，得到細菌群落結構多樣性的各項指標，結果見表4。

由表4可知，遮陰和未遮陰土壤樣品細菌群落結構多樣性指標有所不同，其中遮陰茶園土壤樣品細菌多樣性以及豐富度比未遮陰茶園略高，其細菌多樣性指數最高，Shannon-wiener多樣性指數為4.75，其豐富度較對照略有增加。可見遮陰對茶園土壤中常見細菌種類有一定的影響。從均勻度指數來看，遮陰處理茶園土壤細菌均勻度指數均比未遮陰茶園有所增加，但差異不顯著。

對DGGE圖譜中18條主要條帶進行測序，并在NCBI的GenBank上作核酸序列比對，找到與目標細菌片段相似度高的細菌菌株，結果見表5。所測序列與數據庫中16?S rDNA序列的相似性在96%~100%。鑒定結果表明，抹茶茶園根際土壤優勢細菌主要是非可培養細菌，占67%，其余33%經鑒定為可培養細菌，分別隸屬于、、擬桿菌屬（）、節桿菌屬（sp）、鏈霉菌（sp）和屬。

注：CK為非遮陰土樣，1~3為遮陰土樣的3個重復

表4 抹茶茶園土壤微生物DGGE條帶多樣性指數、豐度及均勻度

表5 抹茶茶園土壤細菌群落DGGE切膠條帶序列比對結果

2.3 抹茶茶園土壤真菌群落PCR-DGGE分析

本試驗通過PCR-DGGE技術研究遮陰和非遮陰抹茶茶園土壤真菌群落結構多樣性，結果見圖1-B。結果遮陰和未遮陰茶園土壤樣品的DGGE圖譜中有許多共同條帶，說明長期單一化種植造成了茶園土壤特殊的微環境，土壤中存在共同的真菌類型。從圖1-B可以看出，茶園土壤在DGGE圖譜中電泳條帶數目、強度和遷移率均存在差別。遮陰茶園土壤真菌多樣性以及豐富度均高于未遮陰茶園。其中條帶F2、F4、F5、F6、F11、F13和F14在所有土壤樣品種都存在。不同土壤樣品中也存在一些特異性條帶，表明不同茶園土壤真菌群落結構有差別，如條帶F7、F8和F13為樣本遮陰茶園所特有條帶。真菌多樣性指數最高的是遮陰茶園土壤，指數為4.26，其豐度也最高，達到21。從DGGE條帶中選取19個條帶進行克隆測序，將切膠回收的18個真菌目的片段DNA在NCBI的GenBank上作核酸序列比對，找到與該目標真菌片段相似度高的真菌菌種（表6）。從表6可以看出，所有序列與數據庫中18?S rDNA序列的相似性在95%~100%，鑒定結果表明，抹茶茶園根際土壤優勢真菌主要是一些非可培養真菌，占79%，其余21%經鑒定為可培養真菌，這些真菌主要分布在酵母屬（）、核盤菌屬（）和曲霉屬（sp）等，雖然以上這些真菌都是自然土壤中的重要菌群，但它們與多酚類化合物的代謝關系并不非常密切[21]。

表6 抹茶茶園土壤真菌群落DGGE切膠條帶序列比對結果

為進一步明確土壤微生物、土壤化學和土壤酶之間的關系，分析了微生物特征指標和土壤酶活性、土壤化學指標之間的相關性。結果表明細菌多樣性和pH呈極顯著相關（<0.01）。楊向德等[20]研究也表明，土壤pH對土壤細菌數量和微生物多樣性有影響。茶園土壤細菌多樣性和有機質以及水解氮呈極顯著相關（<0.01），以上均說明肥力高的土壤有利于提高土壤微生物活性。細菌均勻度指數與全氮、有機質、全磷以及水解氮、酸性磷酸酶等都呈極顯著相關（<0.01）。真菌多樣性指數與全磷和蛋白酶、酸性磷酸酶、有機質和水解氮等均呈極顯著相關（<0.01）。遮陰茶園土壤養分、土壤酶活以及土壤微生物多樣性都高于未遮陰茶園土壤，因此相關性都極顯著。

3 討論

近年來，抹茶被廣泛應用于乳制品、烘焙、冷食、飲料、保健食品以及日化產品等眾多行業。中國的抹茶生產和加工尚處于起步階段。遮陰為抹茶茶園栽培的關鍵技術。有研究表明，遮陰技術是影響抹茶品質的關鍵因子之一，通過遮陰能提高抹茶游離氨基酸含量，而游離氨基酸茶清新口感的重要組成部分，是抹茶品質的風味成分與功能成分。遮陰可以提高茶樹氨代謝水平，增加茶葉游離氨基酸含量[8]。本研究希望了解遮陰網遮陰對茶園土壤養分、酶活性以及土壤微生物群落的的影響。

本研究結果表明，遮陰抹茶茶園土壤有機質、全氮、全磷、堿解氮、有效磷和速效鉀含量顯著大于未遮陰茶園，特別是有效磷成倍增加。段建真等[22]發現在烏桕、杉樹等遮蔭樹下茶園土壤有機質和有效態的氮、磷、鉀含量也有明顯的增加，有機質含量也比對照有明顯增加，大大提高了茶樹營養狀態，有利于茶葉產量和品質的提高。與本研究結果趨勢一致。

遮陰和未遮陰茶園土壤pH均小于4.5，有酸化趨勢。雖然茶樹喜歡酸性土壤介質，但最佳pH應當在4.5~5.5的范圍，過低易導致茶樹生長不良、產量低、茶葉品質差。研究表明，土壤pH與有效態養分含量之間有密切的關系，土壤酸化易造成土壤結構差、肥力低且重金屬含量增加，影響茶樹生長發育[20]。遮陰抹茶茶園土壤pH為4.33。該樣地有機質、全氮、全磷、有效磷、水解氮以及有效鉀含量都比對照要高，可能由于遮陽網的作用，土壤化學成分有改善。因此提高土壤pH、防止酸化應當成為當地抹茶茶園土壤改良和培肥的目標。同時研究表明，遮陰茶園土壤蛋白酶、脲酶和磷酸酶活性的增幅均比未遮陰茶園顯著，這與以往的研究結論基本一致[23-24]，說明遮陰栽培更有利于增強土壤各種酶活性，從而促進土壤氮、碳及磷元素的循環利用，提高土壤肥力，增加茶樹的養分供應。可能是因為遮陰覆蓋茶園具有更高的郁閉度，減少了晝夜溫差，特別是夜間溫度保持較高，濕度比較適中[25]，這些因素綜合導致了遮陰覆蓋茶園土壤酶活性高于未遮陰茶園。

植物根際土壤中存在著大量種類豐富的微生物，這些微生物會對植物的代謝作用、根際土壤中的物質轉化產生影響，進而在很大程度上影響植物的生長。茶園根際土壤微生物群落結構是一個復雜的有機體，本研究主要明確了細菌和真菌群落結構分布與茶園遮陰的關系。遮陰茶園土壤細菌、真菌Shannon指數和豐富度都略高于未遮陰茶園，變化不顯著，但高于前期文獻數據[26]，說明抹茶茶園整體土壤微生物活性較好。過氧化氫酶、脲酶、轉化酶和磷酸酶是與土壤養分轉化密切相關的幾種酶類，其活性的變化也極易受到微生物種群變化的影響。遮陰可以有效調節土壤溫、濕度，這些都是提高土壤微生物整體活性的重要原因[27]。土壤微生物活性的增加有利于茶園土壤養分轉化，提高茶葉產量和品質。

本研究發現的許多優勢細菌和真菌都屬于未分類，主要是非可培養細菌，而可培養細菌較少，如細菌中的6號和11號條帶，真菌中的6號、7號和11號條帶。與?akmak?i等[28]研究發現茶園土壤中可培養的細菌主要有芽孢桿菌屬（34.6%）、假單胞菌屬（8.9%）等不同。這表明隨著抹茶茶園生態系統的確立，土壤微生物群落多樣性將會發生較大變化，一些微生物種類因不能適應獨特的茶園土壤環境而死亡，而另一些微生物種類因能適應或忍耐改變的環境而存在于茶園生態系統中，抹茶茶園可能存在一些特殊的細菌和真菌。相關性分析也表明抹茶茶園土壤細菌多樣性和真菌多樣性與有機質以及水解氮呈極顯著正相關，較好印證了土壤理化性狀改善和土壤有機質提高。這些土壤化學性質的改善有利于增加土壤微生物數量。這與以往的研究結論基本一致[10,29]。綜上所述，生產抹茶為主的茶園通過遮陰技術可以顯著增加土壤營養，微生物的數量和活性，并提升與土壤養分轉化密切相關的酶類的活性，有利于抹茶茶園土壤生態系統的恢復與重建，全面提高土壤質量。

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Effects of Shading on Microbial Characteristics and Enzyme Activities in Matcha Tea Garden Soil

WANG Guofu, SUN Xiaohong*, FANG Yi, ZHOU Jin, SHEN Qianting, XIANG Junlei, JIN Xianling, LUO Xingyun

Yuanpei College, Shaoxing University, Shaoxing 312000, China

The effects of shading on soil microorganism characteristics, soil nutrient and enzyme activity changes in matcha tea garden of Zhejiang province were analyzed. The results show that shading could significantly increase the contents of organic matter, total nitrogen, hydrolyzed nitrogen, total phosphorus, available phosphorus and available potassium in soil layer of 0-20?cm. In addition, the organic matter in the soil of shading tea garden reached 49.81?g·kg-1, which was significantly higher than that of the control (32.50?g·kg-1,<0.05). Shading treatment could significantly improve the activities of urease, invertase, soil protease, acidic phosphatase and alkaline phosphatase in soil (<0.05). The microorganism related indexes such as bacteria and fungi Shannon-wiener diversity indexes (H) and Richness in shading tea garden were also higher than those without shading treatment. Shading on matcha tea garden could increase the number and activities of soil microorganisms, and upgrade soil enzyme activities which were related to soil nutrient. This would enhance soil quality and facilitate the restoration or rebuilding of the damaged soil ecosystem in tea garden.

matcha tea garden, shading, soil microbial, soil enzyme, soil nutrient

S571.1；S154.1

A

1000-369X(2019)03-355-09

2018-12-07

2019-03-21

紹興市科技計劃項目（2014B70032）、浙江省自然科學基金項目（LQ19C160003）

王國夫，男，副教授，主要從事植物植物栽培方面的研究。E-mail：wgf83@usx.edu.cn。*通信作者：xhsun2000@163.com