白葉1號白化過程中葉綠體蛋白質組差異分析

李勤，程曉梅，李永迪，楊培迪，黃建安,3*，劉仲華*

?

白葉1號白化過程中葉綠體蛋白質組差異分析

李勤1,2,3，程曉梅1，李永迪1，楊培迪4，黃建安1,3*，劉仲華1,2,3*

1. 湖南農業大學/茶學教育部重點實驗室，湖南 長沙 410128；2. 國家植物功能成分利用工程技術研究中心，湖南 長沙 410128；3. 湖南省植物功能成分利用協同創新中心，湖南 長沙 410128；4. 湖南省農業科學院茶葉研究所，湖南 長沙 410128

白葉1號是一種溫度敏感型白化茶樹品種，葉綠體的變化是其產生階段性白化現象的關鍵因素。本研究以白葉1號鮮葉葉綠體為研究對象，采用雙向電泳、質譜鑒定結合生物信息學分析，研究階段性白化過程中葉綠體蛋白的表達差異，探討白葉1號階段性白化現象的分子機制。結果表明，在白葉1號白化前期、白化期和復綠期葉綠體中分別識別726、748、718個蛋白質，其中差異表達的蛋白59個，質譜成功鑒定22個差異表達蛋白。生物信息學分析表明，差異表達蛋白直接或間接參與了光合作用、應激響應、核酸代謝、物質代謝和未知功能等，其中與光合作用相關的差異表達蛋白最多，占31.82%，表明階段性白化現象可能與這些生理功能相關。通過熒光定量PCR分析發現，差異蛋白的基因表達與蛋白表達存在一定差異，這可能是由于蛋白質翻譯后加工及修飾造成的。上述研究為進一步揭示白葉1號階段性白化現象產生的分子機制奠定了理論基礎。

白葉1號；階段性白化；葉綠體蛋白質組；雙向電泳

白葉1號是一種低溫敏感型白化茶樹品種，因其新梢階段性白化現象和白化期較高的氨基酸含量而備受關注。多年田間觀察發現，白葉1號階段性白化現象與新梢萌芽期溫度密切相關[1]。白化期間，其一芽二葉氨基酸含量比普通綠茶品種高1倍，茶多酚含量僅為普通綠茶品種的1/2[2]。研究表明，白葉1號葉色突變和高氨基酸含量的形成機制非常復雜，受溫度、光照等外界環境因素和基因、蛋白變化等內在因素的共同影響[3-5]。我們前期研究發現，白葉1號階段性白化過程中，葉綠體內囊體片層膜結構被破壞、葉綠素生物合成受阻、質體發育停滯，導致白化現象的產生。因此，我們推測葉綠體的變化是白葉1號階段性白化現象的關鍵因素[6]。葉綠體是植物進行光合作用的重要細胞器，同時也是植物進行多種生理代謝所必需的場所。植物亞細胞結構分離技術快速發展，亞細胞蛋白質組學已成為植物蛋白質組學研究中的一個新熱點[7]。張立明等[8]比較了不同茶樹葉綠體分離及葉綠體蛋白質的提取方法，并采用雙向電泳技術分離了約350個茶樹葉綠體蛋白質，發現葉綠體蛋白質點主要集中于等電點3~5之間。但目前關于白葉1號階段性白化過程中葉綠體蛋白質組的變化尚未見報道，阻礙了白葉1號白化現象的分子機制研究。

本研究以白葉1號階段性白化過程中不同階段鮮葉葉綠體為研究對象，采用雙向電泳結合質譜技術研究階段性白化過程中葉綠體蛋白質組的變化，為白葉1號階段性白化現象形成的分子機制研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

白葉1號階段性白化期間樣品取自湖南省茶葉研究所高橋試驗基地茶園。根據葉片顏色變化，采集階段性白化過程中3個典型階段葉片，包括白化前期、白化期和復綠期。取帶葉枝條插入水中，迅速帶回實驗室，立即進行后續樣品處理。

1.2 方法

1.2.1 葉綠體制備

葉綠體粗提物[9]：取25.0?g茶樹鮮葉，然后加入200?mL預冷的葉綠體提取液（330?mmoL·L-1L-山梨醇，50?mmoL·L-1HEPES，2?mmoL·L-1EDTANa2，1?mmoL·L-1MgCl2，1?mmoL·L-1MnCl2，0.5?g·L-1牛血清白蛋白，0.05%-巰基乙醇，pH 8.0），于預冷的勻漿杯中低速勻漿3次，每次10?s；4層紗布過濾，濾液于4℃，500×條件下，離心10?min，棄沉淀；取上清液于4℃，2?000×條件下，離心10?min，棄上清；沉淀重懸于預冷的葉綠體提取液中，于4℃，2?000×條件下，離心10?min，棄上清；沉淀重懸于3?mL預冷的葉綠體洗滌緩沖液（330?mmoL·L-1L-山梨醇，50?mmoL·L-1HEPES，2?mmoL·L-1EDTANa2，1?mmoL·L-1MgCl2，1?mmoL·L-1MnCl2，0.05%-巰基乙醇，pH 8.0），即得葉綠體粗提液。

葉綠體純化[10]：取3?mL葉綠體粗體液平鋪于Percoll密度梯度液（3?mL 80% Percoll，3?mL 40% Percoll）上層，4℃，18?000×，離心60?min，用注射器吸取40%和80% Percoll密度梯度液之間的綠色條帶至干凈的離心管中，重懸于葉綠體洗滌緩沖液，4℃，12?000×離心10?min，沉淀即為純化的完整葉綠體。

（3）葉綠體完整性與純度檢測：葉綠體完整性采用希爾反應法檢測[11]；葉綠體純度采用過氧化氫酶活性和延胡索酸酶活性檢測法測定[12]。

1.2.2 葉綠體蛋白質樣品制備

采用三氯乙酸丙酮沉淀法[13]，將純化的葉綠體與10%的三氯乙酸丙酮溶液按1∶15（∶）渦旋混勻，–20℃放置至少4?h，沉淀蛋白；放置后將混合液在4℃，12?000×條件下離心10?min，棄上清液，向沉淀中加入1?mL預冷的100%丙酮（含0.07%的-巰基乙醇）渦旋混勻后繼續離心10?min，至少重復洗滌沉淀3次；棄上清液，向沉淀中加入1?mL 80%預冷的丙酮（含0.07%的-巰基乙醇），混勻后離心，條件為4℃，12?000×，10?min，至少重復3次，洗至上清無色透明為止；棄去上清液，將打開管口的離心管置于冰上揮發丙酮，稱重，所得沉淀即為葉綠體中的蛋白質，–20℃中保存備用。

將冷凍的蛋白沉淀按1∶15（∶）加入蛋白質裂解液，充分混勻后按體積比1∶50加入蛋白抑制劑，渦旋混勻置于冰上靜置2?h，每半小時震蕩混勻1次，之后超聲破碎6次，總共1?min（超聲5?s，停5?s），讓蛋白質充分溶解，4℃，12?000×離心15?min，用移液槍吸取上清液到新的離心管中，即為葉綠體蛋白質樣品，置于–20℃中保存備用。

1.2.3 雙向電泳及質譜鑒定

參考Li等[6]的方法，采用17?cm，pH 4~7的IPG預制膠條，上樣量350?μg，上樣體積400?μL，50?V主動水化12?h。等電聚焦（IEF）條件：250?V緩慢升壓1?h，500?V緩慢升壓1?h，1?000?V緩慢升壓3?h，10?000?V線性升壓5?h，10?000?V快速升壓至6?h，500?V保存。聚焦后IPG預制膠條經2次平衡，12%分離膠進行SDS-PAGE電泳分離。Blue silver膠體考染[12]，圖像掃描，利用Bio-Rad公司PDquest軟件對凝膠進行圖像分析。每組樣品進行3次生物學重復試驗。參考Li等[6]的方法，將差異表達的蛋白質點經膠內酶解、酶解肽段抽提、ZipTip脫鹽、真空濃縮、質譜檢測、數據庫檢索對差異表達蛋白質點進行鑒定。

1.2.4 熒光定量PCR分析

表1 實時熒光定量PCR引物序列

2 結果與分析

2.1 白葉1號葉綠體制備

采用Percoll密度梯度離心法對葉綠體進行分離純化，梯度介質中從上至下形成兩條綠色條帶，純化的完整葉綠體主要聚集在40%與80% Percoll分離介質梯度之間（圖1，第二條綠色條帶）。如表2所示，經Percoll密度梯度離心法純化后，葉綠體得率為每100?g鮮葉可獲得(8.31±0.03)?mg葉綠體，葉綠體完整率為(73.68±0.54)%；線粒體和微粒體標志酶活性檢測表明（圖2），單位時間內純化的葉綠體提取液過氧化氫酶和延胡索酸酶活性無顯著性變化（＞0.05），表明純化的葉綠體提取液中無線粒體和微粒體污染，適合下一步試驗要求。

2.2 葉綠體蛋白質組雙向電泳

采用pH為4~7的IPG預制膠條和12%的SDS-PAGE膠對白葉1號白化前期、白化期及復綠期葉綠體蛋白質組樣品進行雙向電泳分離，染色后經PDQuest軟件識別白化前期蛋白點726個，白化期748個，復綠期718個，其中豐度表達變化在1.5倍以上且Student’s-test檢驗差異顯著（<0.05）、重復性好的差異蛋白質點共計59個（圖3）。差異蛋白質分為4種表達類型：類型Ⅰ：在白化期下調表達的蛋白質點，共計39個，占總差異蛋白66.10%，其中7個蛋白質點在白化期未表達；類型Ⅱ：在白化期上調表達的蛋白質點，共計15個，占總差異蛋白25.42%，其中13個蛋白質點僅在白化期表達；類型Ⅲ：在白化前期、白化期和復綠期連續上調表達的蛋白質點，共計3個，占總差異蛋白5.08%；類型Ⅳ：在白化前期、白化期和復綠期連續下調表達的蛋白質點，共計2個，占總差異蛋白3.39%。

圖1 葉綠體密度梯度離心

表2 葉綠體得率、完整性及純度

注：圖中數字表示差異蛋白質點編號，A：白化前期，B：白化期，C：復綠期

Note: The numbers represent the different proteins. A: Pre-albinistic stage, B: Albinistic stage, C: Regreening stage

圖3 白葉1號階段性返白過程中葉綠體蛋白質的雙向電泳圖譜

Fig. 3 Two-dimensional electrophoresis gel of separated chloroplast proteins in Baiye 1 during periodic albinism

2.3 差異蛋白質質譜鑒定及生物信息學分析

從上文所述的4種表達模式差異蛋白質中，選取25個不同分子質量、不同等電點、分離效果好、重復性好，且差異表達豐度大于1.5倍的差異蛋白點。經脫色、酶解、抽提和脫鹽后，進行質譜鑒定。經數據庫檢索后，成功鑒定22個差異蛋白點，鑒定成功率為88.00%（表3）。根據差異蛋白質的功能，可將它們分為5類，分別為：與光合作用相關7個，占31.82%，白化期均呈現顯著的下調表達，復綠期表達量又逐漸恢復；與應激響應相關5個，占22.73%；與核酸代謝相關3個，占13.64%；與物質代謝相關4個，占18.18%；未知功能的蛋白質3個，占13.64%。

2.4 熒光定量PCR驗證

從鑒定到的與光合作用、核酸代謝和應激響應功能相關的差異蛋白中挑選5個差異蛋白質對其基因表達情況進行分析。結果表明（圖4），熱激蛋白70、核酮糖1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶大亞基、-腺苷甲硫氨酸合成酶和ATP合成酶CF1亞基基因表達情況與蛋白質表達情況一致。但真核起始因子5A4基因表達情況與蛋白質表達情況有一定差異；與白化期相比，真核起始因子5A4在白化前期基因水平為上調表達，而蛋白質水平為下調表達。蛋白質和基因表達的差異可能是由于蛋白質翻譯的可變剪切，磷酸化和糖基化等翻譯后修飾造成。

3 討論

葉綠體是植物進行光合作用的一個重要細胞器。目前，對于葉綠體蛋白組學的研究主要分為葉綠體整體的蛋白質組學和葉綠體內不同組成部分的蛋白質組學，如葉綠體膜蛋白組學、葉綠體基質蛋白組學和葉綠體類囊體蛋白組學[15]。本研究采用蛋白質組學研究技術，研究了白葉1號階段性白化過程中葉綠體蛋白質表達的變化，并對差異蛋白質鑒定及功能分析。

3.1 光合作用相關蛋白質

白葉1號階段性白化過程中7個與光合作用相關的蛋白差異表達，其作用涉及光呼吸、光合磷酸化、光合電子傳遞等過程。核酮糖-l,5-二磷酸羧化酶/加氧酶（Rubisco）是植物卡爾文循環（C3循環）和光呼吸的關鍵酶[16]，由8個大亞基（分子量為56?kD）和8個小亞基（分子量為14?kD）組成，葉綠體中Rubisco是在類囊體膜上合成的。Rubisco在C3循環中能夠催化CO2與1,5-二磷酸核酮糖反應生成2分子3-磷酸甘油酸；在光呼吸中Rubisco可以催化O2與1,5-二磷酸核酮糖反應生成1分子3-磷酸甘油酸和1分子磷酸乙醇酸[16]。白葉1號階段性白化過程中鑒定到2個差異表達的Rubisco大亞基蛋白質點（Spot 26，Spot 45），在白化期間發生了下調表達。有研究報道，在小麥白化階段葉片蛋白質組分和含量顯著降低，其中以Rubisco亞基的降低幅度最大[17]。翁曉燕等[18]在白化水稻突變體階段性白化過程中發現，白化苗類囊體片層結構缺乏，Rubisco含量顯著降低；隨葉片轉綠，類囊體片層結構逐漸恢復并增多，Rubisco含量也隨之顯著增加，推測白化期間Rubisco含量顯著降低與葉綠體類囊體片層結構缺失有關。我們前期研究也表明，白葉1號在白化期間葉綠體類囊體膜結構被破壞[6]。因此，白化期間葉綠體Rubisco含量顯著降低可能與類囊體膜片層結構缺失，導致Rubisco合成受阻有關。能量傳遞是光合作用的重要組成部分，而ATP合成酶是能量代謝的關鍵酶，其參與光合作用中的光合磷酸化及氧化磷酸化過程，將光能轉化為化學能[19]。葉綠體中的ATP合酶位于類囊體膜上，由CF0和CF1兩部分組成[20]。白葉1號階段性白化過程中，ATP合酶（Spot 32，Spot 38，Spot 42）表達量隨著葉片的白化而呈現下降趨勢，當葉片顏色逐漸復綠，該酶的表達量逐漸增強。有文獻報道，葉綠體類囊體膜上若除去CF1的亞基，ATP合酶將失去催化ATP合成的能力，當添加外源亞基，ATP合成能力就可得到恢復[21]。毛娟等[22]研究也表明，植物ATP合成酶的缺失會導致植物葉色黃化，光合電子傳遞受到影響。因此，推測白葉1號階段性白化過程中，由于葉綠體類囊體膜結構破壞，影響了ATP合酶組裝，導致葉色出現白化，ATP合成受阻；同時，C3受到抑制，使凈光合速率下降；后期隨著葉綠體類囊體膜結構逐漸恢復，ATP合成酶組裝隨之恢復，光合速率逐漸增強。細胞色素b5是生物體內氧化反應的電子傳遞組分，還能夠促進膜的合成[23]。本研究中，細胞色素b5（Spot 27，Spot 39）在白葉1號白化期表達量降低，影響電子傳遞，阻礙了白化期葉片光合作用。

注：Spot 14：熱激蛋白70，Spot 26：核酮糖1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶大亞基，Spot 28：真核起始因子5A4，Spot 34：S-腺苷甲硫氨酸合成酶，Spot 38：ATP合成酶CF1β亞基。*表示P＜0.05，**表示P＜0.01

表3 葉綠體差異蛋白點質譜鑒定結果

3.2 核酸代謝相關蛋白質

葉綠體是含有自身遺傳物質的一類細胞器，其基因的表達受轉錄水平的調控。白葉1號階段性白化期間3個差異表達蛋白與核酸代謝及調控相關。葉綠體RNA結合蛋白（Spot 54）定位于葉綠體，與葉綠體基因轉錄后調控密切相關，它與細胞核的RNA結合蛋白具有相似的功能，包括維持RNA穩定、RNA翻譯后調控等過程[24]。白葉1號階段性白化期間，RNA結合蛋白表達量在白化期顯著降低，隨著葉片逐漸轉綠其表達量又呈上升狀態，推測可能與白化期葉綠體發育停滯有關。有報道指出，葉綠體RNA結合蛋白與葉綠體中核糖體復合體的裝配及葉片的發育關系密切[25]，葉綠體RNA結合蛋白表達水平能對光合作用產生調控作用，且葉綠體中mRNAs的穩定性會因葉綠體發育的變化而變化[26]。我們前期研究表明，白葉1號白化期葉片光合速率顯著降低，可能也與白化期RNA結合蛋白表達量降低抑制了葉綠體核糖體組裝有關[27]。真核起始因子（eIF）在真核生物翻譯過程中具有RNA解旋酶的作用。白葉1號階段性白化期間，eIF（Spot 23，Spot 28）表達量在白化期顯著降低可能與白化期葉綠體基因翻譯減少，蛋白質合成受到抑制有關。

3.3 應激響應相關蛋白質

植物在遭受逆境脅迫時，會產生應激響應，增強自身對脅迫環境的適應性。熱激蛋白（HSP）在逆境脅迫下大量表達，以增強植物的抗逆性，根據分子質量可分為Hsp100、Hsp90、Hsp70、Hsp60、Hsp40等[28]。Hsp70主要通過參與機體內蛋白質的合成、折疊及組裝和協助降解變性蛋白等多種過程來維持脅迫環境下植物機體內環境穩定，增強適應性[29]。Hsp70蛋白存在于植物葉綠體膜和基質，有利于維持葉綠體正常結構及葉綠體形成，是葉綠體發育的必要條件。白葉1號階段性白化期間，Hsp70（Spot 14）表達量在白化期顯著降低，復綠期逐漸升高，可能與白化期間葉綠體發育停滯，復綠期間葉綠體重新形成有關，在白化小麥突變株中也獲得相同結果[30]。

S-腺苷甲硫氨酸合成酶（SAMS）催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）合成，SAM是合成乙烯和多胺的甲基供體。乙烯和多胺都參與了植物的抗逆反應，因而SAMS在植物抗逆中可能發揮一定的作用。本研究中，白葉1號白化期，SAMS（Spot 34）表達量顯著提高，可能是因白化期間葉綠體被破壞，茶樹產生了抗逆反應所致。

H2O2是葉綠體中光合電子傳遞和酶學反應的重要活性氧，但過量的H2O2會引起細胞損傷，因此應及時清除H2O2，維持葉綠體正常的光合作用。逆境環境下植物會產生過量的活性氧，損傷植物細胞?？箟难徇^氧化物酶（APX）是植物體內清除H2O2的關鍵酶，可分為葉綠體基質APX（sAPX）、類囊體APX（tAPX）、微體APX（mbAPX）和胞質APX（cAPX）[31]。有研究報道，菠菜完整葉綠體基質中含有一種以光化還原劑為電子供體的過氧化物酶，即APX，但在不完整的葉綠體中APX活性很低[32]。也有報道，抗壞血酸過氧化物酶存在于白化突變苗中，而在綠苗中缺失[33]，上述結果可能是由于不同植物中APX對各種環境因素的敏感性不一致而造成的[31]。在白葉1號白化期，APX（Spot 20）表達量的降低推測是由于葉綠體發育停滯、成熟葉綠體結構不完整導致APX表達量降低，隨著復綠期葉綠體結構逐漸恢復，APX表達量也有所提高。

植物光合作用時，葉綠體中蛋白質常受到各種損傷而喪失功能，葉綠體中分子伴侶蛋白負責受損蛋白的重新折疊，蛋白酶負責清除不能修復的蛋白，蛋白酶對葉綠體的發育及結構維持具有重要作用[34]。ATP依賴型Clp蛋白酶主要位于葉綠體基質，能降解多種基質蛋白，在葉綠體發育過程中起著重要作用。Sjogren等[35]報道，抑制擬南芥ClpP6表達后，幼葉呈黃化表型，其底物主要是調控蛋白質合成、折疊等功能的基質蛋白。白葉1號白化期間，ATP依賴型Clp蛋白酶（Spot 22）表達在白化期有一定程度的上升，進入復綠階段進一步顯著上升。推測由于白化期，葉綠體結構破壞，產生功能大量變性蛋白質，誘導ATP依賴型Clp蛋白酶表達，但由于葉綠體發育停滯僅有少量葉綠體存在，因而ATP依賴型Clp蛋白酶表達量提高有限；隨著葉片逐漸復綠，葉綠體結構和發育恢復正常，光合作用逐漸增強，ATP依賴型Clp蛋白酶表達量顯著提升。

3.4 脂質代謝相關蛋白質

脂肪酸是植物體的重要組分，在生物膜合成、信號的轉導及能量儲存等方面具有重要作用。羥脂酰-ACP脫水酶（HAD）參與Ⅱ型脂肪酸合成代謝，主要作用是催化可逆反應羥酰-ACP脫水生成烯酰-ACP[36]。在植物體中飽和脂肪酸合成途徑大部分發生在葉綠體中，Ferro等[37]利用液質聯用技術在擬南芥中鑒定到與葉綠體脂質代謝相關的膜蛋白。白葉1號階段性白化期間，HAD（Spot 41）在白化期含量顯著降低，可能與葉綠體膜結構破壞有關，但HAD與葉片的白化是否有關仍需進一步研究。

葉綠體是植物光合作用必需場所，白葉1號階段性白化過程中光合作用發生了顯著變化，研究白葉1號階段性白化過程中葉綠體蛋白質組的變化，對了解和發現白葉1號白化期葉色突變和高氨基酸含量具有重要意義。本研究通過雙向電泳結合質譜技術在亞細胞和蛋白質水平上鑒定了白化過程中部分差異表達的葉綠體蛋白質，發現這些差異表達蛋白質直接或間接參與光合作用、能量代謝、應激響應、脂質代謝等生理生化過程，其中與光合作用相關的差異表達蛋白最多，表明這些生理生化過程的變化可能與白葉1號階段性白化現象有關。這些結果為闡明白葉1號階段性白化現象的分子機制提供了一定的理論基礎。

[1] 李素芳. 安吉白茶返白機理的研究[J]. 中國計量學院學報, 2002, 13(3): 214-217.

[2] 楊普香, 李文金, 聶樟清, 等. 安吉白茶茶多酚和氨基酸含量初探[J]. 蠶桑茶葉通訊, 2007(5): 33-34.

[3] 成浩, 李素芳, 陳明, 等. 安吉白茶特異性狀的生理生化本質[J]. 茶葉科學, 1999, 19(2): 87-92.

[4] 曾超珍, 劉仲華. 安吉白茶階段性白化機理的研究進展[J]. 分子植物育種, 2015, 13(12): 2905-2911.

[5] 盧翠, 沈程文. 茶樹白化變異研究進展[J]. 茶葉科學, 2016, 36(5): 445-451.

[6] Li Q, Huang J, Liu S, et al. Proteomic analysis of young leaves at three developmental stages in an albino tea cultivar [J]. Proteomecience, 2011, 9(1): 44. https://doi.org/10.118 6/1477-5956-9-44.

[7] 賀庭琪, 郭安平, 杜偉, 等. 植物葉綠體蛋白質組學研究進展[J]. 熱帶作物學報, 2011, 32(11): 2196-2203.

[8] 張立明, 劉亞軍, 王云生, 等. 茶樹葉綠體及其蛋白的分離研究[J]. 激光生物學報, 2011, 20(6): 802-808.

[9] 肖龍, 張彩霞, 宗澤冉, 等. 蘋果葉片應答輪紋病菌脅迫的葉綠體蛋白質組學分析[J]. 果樹學報, 2016, 33(11): 1357-1366.

[10] 肖龍, 張彩霞, 張利義, 等. 蘋果葉片葉綠體分離及其蛋白提取、雙向電泳方法的優化[J]. 果樹學報, 2016, 33(6): 752-761.

[11] Lydia Macias-Rubalcava M, Claudia Garcia-Mendez M, King-Diaz B, et al. Effect of phytotoxic secondary metabolites and semisynthetic compounds from endophytic fungus Xylaria feejeensis strain SM3e-1b on spinach chloroplast photosynthesis [J]. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology, 2017, 166: 35-43.

[12] Kley J, Heil M, Muck A, et al. Isolating intact chloroplasts from small Arabidopsis samples for proteomic studies [J]. Analytical Biochemistry, 2010, 398(2): 198-202.

[13] 李勤, 黃建安, 劉碩謙, 等. 茶樹蛋白質雙向電泳樣品制備技術研究[J]. 茶葉科學, 2011, 31(3): 173-178.

[14] Chomczynski P, Mackey K. Short technical reports. Modification of the TRI reagent procedure for isolation of RNA from polysaccharide- and proteoglycan-rich sources [J]. BioTechniques, 1995, 19(6): 942-945.

[15] Baginsky S, Gruissem W. Chloroplast proteomics: potentials and challenges [J]. Journal of Experimental Botany, 2004, 55(400): 1213-1220.

[16] Spreitzer RJ, Salvucci ME. Rubisco: Structure, regulatory interactions, and possibilities for a better enzyme [J]. Annual Review of Plant Biology, 2002, 53: 449-475.

[17] 蘇小靜, 汪沛洪, 王永吉. 小麥突變體返白系返白機理研究-Ⅲ.返白階段葉蛋白質、游離氨基酸變化規律的分析[J]. 西北農林科技大學學報(自然科學版), 1990, 18(4): 16-22.

[18] 翁曉燕, 蔣德安, 陸慶. 水稻轉綠型白化突變系W25轉綠過程中Rubisco、Rubisco活化酶活性與光合速率的變化[J]. 植物生理學報, 2000, 26(3): 213-225.

[19] Igamberdiev AU, Kleczkowski LA. Optimization of ATP synthase function in mitochondria and chloroplasts via the adenylate kinase equilibrium [J]. Frontiers in Plant Science, 2015, 6: 10. https://doi.org/10.3389/fpls.2015.00010.

[20] Rast A, Heinz S, Nickelsen J. Biogenesis of thylakoid membranes [J]. Biochimica Et Biophysica Acta-Bioenergetics, 2015, 1847(9): 821-830.

[21] 董慧. 葉綠體ATP合酶的活性調節與亞基的定點突變[D]. 上海: 中國科學院研究生院（上海生命科學研究院）, 2005.

[22] 毛娟, 遲偉, 馬今方, 等. 擬南芥PAB1蛋白參與葉綠體ATP合酶復合物調控機制的研究[J]. 生物物理學報, 2009, 25(S1): 242.

[23] 胡光珍. 香蒲細胞色素b5基因的克隆和功能研究[D]. 上海: 華東師范大學, 2005.

[24] 烏鳳章, 王柏臣, 楊傳平. 白樺葉綠體RNA結合蛋白的蛋白質組學分析(英文)[J]. 中國生物化學與分子生物學報, 2013, 29(2): 144-150.

[25] Dupont FM. Metabolic pathways of the wheat () endosperm amyloplast revealed by proteomics [J]. Bmc Plant Biology, 2008, 8(1): 39. https://doi.org/10.1186/ 1471-2229-8-39.

[26] 張在寶, 李婉杰, 李九麗, 等. 植物RNA結合蛋白研究進展[J]. 中國農業科學, 2018, 51(21): 4007-4019.

[27] 程曉梅. 安吉白茶階段性返白過程中葉綠體蛋白質組學研究[D]. 長沙: 湖南農業大學, 2015.

[28] 栗振義, 龍瑞才, 張鐵軍, 等. 植物熱激蛋白研究進展[J]. 生物技術通報, 2016, 32(2): 7-13.

[29] 王明強, 張道遠. 植物熱激蛋白70基因家族及其生物學功能研究進展[J]. 基因組學與應用生物學, 2015, 34(2): 421-428.

[30] 侯典云. 小麥返白系葉綠體基因組分析及葉綠體超微結構和差異表達蛋白質研究[D]. 楊凌: 西北農林科技大學, 2009.

[31] 孫衛紅, 王偉青, 孟慶偉. 植物抗壞血酸過氧化物酶的作用機制、酶學及分子特性[J]. 植物生理學通訊, 2005, 41(2): 143-147.

[32] 孫云. 茶葉抗壞血酸過氧化物酶（APX）的生理學與分子生物學研究[D]. 福州: 福建農林大學, 2009.

[33] 董紅霞. 水稻苗期葉色突變體的蛋白質組分析[D]. 武漢: 華中農業大學, 2010.

[34] Langer T. AAA proteases: cellular machines for degrading membrane proteins [J]. Trends in Biochemical Sciences, 2000, 25(5): 247-251.

[35] Sjogren LL, Stanne TM, Zheng B, et al. Structural and functional insights into the chloroplast ATP-dependent Clp protease in[J]. The Plant cell, 2006, 18(10): 2635-2649.

[36] Lu Y-J, Zhang Y-M, Rock CO. Product diversity and regulation of type II fatty acid synthases [J]. Biochemistry and Cell Biology-Biochimie et Biologie Cellulaire, 2004, 82(1): 145-155.

[37] Ferro M, Salvi D, Brugiere S, et al. Proteomics of the chloroplast envelope membranes from[J]. Molecular & Cellular Proteomics: MCP, 2003, 2(5): 325-345.

Analysis of the Chloroplast Proteome Difference of ‘Baiye 1’ [(L.) O Kuntze] during Periodic Albinism

LI Qin1,2,3, CHENG Xiaomei1, LI Yongdi1, YANG Peidi4, HUANG Jian'an1,3*, LIU Zhonghua1,2,3*

1. Tea Key Lab of the Ministry of National Teaching of Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China;2. National Research Center of Engineering Technology for Utilization of Botanical Functional Ingredients, Changsha 410128, China;3. Hunan Co-Innovation Center for Utilization of Botanical Functional Ingredients, Changsha 410128, China;4. Tea Research Institute, Hunan Academy of Agriculture Sciences, Changsha 410128, China

‘Baiye 1’ is a kind of temperature sensitive tea cultivar. The change of chloroplast is the key factor for the periodic albinism of ‘Baiye 1’. To understand the mechanism of periodic albinism of ‘Baiye 1’, two dimensional electrophoresis (2-DE) and mass spectrometry was adopted to separate and identify the chloroplast proteins, which were significantly changed during the three developmental periods. The results show that 726, 748 and 718 protein spots were separated at the pre-albinistic, albinistic and regreen stages, respectively. The expression levels of 59 protein spots varied markedly during the three development stages. A total of 22 protein spots were successfully identified by MS, which were involved in photosynthesis, stress response, metabolism of nucleic acid, substance metabolism and unknown function. Photosynthetic proteins were the most affected proteins, which account for 31.82% in the significantly changed proteins. These results indicate that these physiological processes might playcrucial roles in the periodic albinism. The gene expression profiles of the differentially expressed proteins were alsoverified by real-time PCR analysis. The results show that the expressions of genes and proteins were not consistent, which might be related to the protein processing and post-modification. These results provide a theoretical basis for understanding the molecular mechanism of periodic albinism in ‘Baiye 1’.

Baiye 1, periodic albinism, chloroplast proteome, 2-DE

S571.1

A

1000-369X(2019)03-325-10

2018-11-05

2019-01-01

國家自然科學基金（31200522）、湖南省教育廳科研項目（15B116）、湖南省財政廳科技專項（湘財教指[2016]175號）、湖南農業大學校青年基金項目（15QN28）

李勤，男，講師，主要從事茶葉生物化學和種質資源創新方面的研究，E-mail: liqinvip@126.com。*通信作者