囊性纖維化跨膜傳導調節因子在人破骨細胞中表達及其對破骨細胞凋亡的影響

沈國蔚，成心錕，顏世昌，張俊，丁惠民

（南京醫科大學附屬明基醫院骨科，江蘇 南京 210019）

囊性纖維化（Cystic fibrosis，CF）是一種常見的常染色體隱性遺傳病，是由于囊性纖維化跨膜傳導調節因子（Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR）編碼的基因突變引起的嚴重疾病，近年來亞洲發病率約1/10萬，呈上升趨勢[1，2]。CFTR是一種cAMP依賴的氯離子通道蛋白，廣泛表達于各組織的上皮細胞，介導離子和水分在上皮細胞的分泌和轉運。CFTR功能異常是引起CF患者多系統病變的主要原因，主要臨床癥狀為CFTR功能異常所致脂類及其它營養素的吸收障礙、胰腺衰竭以及慢性感染或者細菌引起的二重感染導致的嚴重肺部功能障礙[3，4]，嚴重影響患者的生存質量。近年來研究表明，CFTR參與上皮細胞的凋亡過程[5]。然而CFTR和骨細胞凋亡的關聯研究尚未有報道，而本研究主要目的是探討CFTR在破骨細胞中的表達，以及CFTR對破骨細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

人支氣管細胞系16HBE14，人破骨細胞購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫，胎牛血清及雙抗（青霉素、鏈霉素）購自美國Gibco公司，DMEM細胞培養基購自美國Hyclone公司，PVDF膜購自美國 Sigma公司，Lip2000、SYBR Premix Ex TaqTM II試劑盒購自日本TaKaRa公司，Annexin-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自凱基生物，CTFR、自殺相關因子（Factor associated suicide，Fas）、Fas 配體（Fas ligand，FasL）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde -3 -phosphate dehydrogenase，GAPDH），二抗購自美國Cell Sigaling Technology公司。主要儀器：細胞培養箱購自美國Thermo公司，FACSCanto流式細胞儀購自美國BD公司，Elx800型自動酶標儀購自美國BioTek公司，7300型定量PCR儀購自美國ABI公司，Mini PROTEAN 3小型垂直式電泳儀購自美國Bio Rad公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養和轉染

用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素及100 g/ml鏈霉素的DMEM培養基培養人支氣管細胞系16HBE14和破骨細胞，于37℃、5%CO2恒溫密閉細胞培養箱中培養。每隔2-3天換液1次，待融合70%-80%時，用胰蛋白酶消化傳代進行后續實驗。

1.2.2 RNA提取和real-time RT-PCR

TRIzol法提取細胞的總RNA按照逆轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄獲得cDNA，以cDNA為模板進行RT-PCR，檢測CFTR mRNA表達水平。Real-time RT-PCR按照Roche FastStart Universal SYBR Green Master（ROX）說明書進行，相對基因表達采用2-ΔΔCT 法計算[7]。

1.2.2 蛋白質印跡檢測（Western Blot）

細胞經RIPA裂解液裂解提取蛋白，運用BCA蛋白檢測法對蛋白進行定量檢測，經SDS-PAGE電泳后轉PVDF膜，室溫5%脫脂牛奶封閉1 h。然后加入一抗4℃孵育過夜，再加入HRP標記的二抗室溫孵育1 h。采用化學發光凝膠成像系統檢測，Adobe Photoshop CS4軟件對條帶進行灰度掃描檢測。目的蛋白的灰度值除以內參的灰度值以校正誤差，所得結果代表目的蛋白相對表達量。

1.2.3 流式細胞術

將人支氣管細胞系16HBE14和破骨細胞細胞接種6孔培養板中，1×106/孔，待轉染后，PBS沖洗后，加入Annexin V-FITC和PI，15 min后采用流式細胞儀檢測各組的細胞凋亡率。

1.3 統計學方法

實驗數據應用SPSS 20.0進行統計學分析。兩組之間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（one-way-ANOVA）進行比較，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 CFTR在破骨細胞中的表達

利用Real time PCR和Western Blot的方法，研究體外培養的人破骨細胞中CFTR的表達，并以人支氣管細胞系16HBE14為陽性參照。結果顯示（圖1a和1b），人破骨細胞無論是mRNA水平還是蛋白水平均有表達，但是較人支氣管細胞系16HBE14B的表達水平較低。

圖1 CFTR在破骨細胞中的表達

2.2 CFTR對破骨細胞凋亡的影響和機制

2.2.1 構建CFTR超表達載體

運用基因工程手段[8]構建含有GFP的CFTR超表達載體，通過病毒感染的方法導入體外培養的人破骨細胞中，從基因水平上調CFTR的表達，Western Blot驗證CFTR蛋白表達上調，證明載體轉染成功（圖2）。

圖2 構建CFTR超表達載體

2.2.2 超表達CFTR對破骨細胞凋亡的影響

應用流式細胞儀檢測CFTR超表達后對破骨細胞凋亡率的影響，圖3結果顯示，SiRNA轉染組的凋亡率較對照組和空白轉染組顯著提高。結果證明，轉染后超表達CFTR，會促進破骨細胞的凋亡。

2.2.3 超表達CFTR對破骨細胞中Fas/FasL表達的影響

利用Real-time PCR和Western Blot法檢測體外培養破骨細胞Fas/FasL的表達，結果顯示：轉染組凋亡相關蛋白Fas及FasL的表達，無論是mRNA水平還是蛋白水平，均較對照組及空白轉染組升高更為明顯。說明轉染后，CFTR高表達，通過促進凋亡相關蛋白Fas及FasL的表達，進而促進破骨細胞的凋亡，見圖4。

圖3 超表達CFTR對破骨細胞凋亡的影響

圖4 超表達CFTR對破骨細胞Fas/FasL表達的影響

3 討論

CF是一種常見的常染色體隱性遺傳病，是由于CFTR編碼基因突變引起的嚴重疾病，發病率約1/10萬[1,2]。CFTR是一種cAMP依賴的氯離子通道蛋白，廣泛表達于各組織的上皮細胞，介導離子和水分在上皮細胞的分泌和轉運。CFTR功能異常是引起CF患者多系統病變的主要原因，主要臨床癥狀為CFTR功能異常所致脂類及其它營養素的吸收障礙、胰腺衰竭以及慢性感染或者細菌引起二重感染所致嚴重的肺部功能障礙[3,4]，嚴重影響患者的生存質量。近年來研究表明，CFTR參與上皮細胞的凋亡過程。在呼吸系統中，Durieu等[5]發現CFTR可以通過Fas和FasL促進氣道上皮細胞凋亡；在消化系統中，Rottner等[6]研究發現CFTR異常表達會導致胰腺細胞過度氧化應激引起凋亡增高；而在生殖系統中，研究發現CFTR在性激素刺激下高表達可能引起子宮內膜細胞凋亡的增加，進而影響子宮內膜容受性[7]。

然而，CFTR和骨細胞凋亡的關聯性尚有待深入研究。有學者發現，CFTR蛋白在人骨組織成骨細胞和破骨細胞中均有表達，主要定位在成骨細胞和破骨細胞的細胞漿中[8]。Bronckers等[9]在人和小鼠的成釉質細胞、成牙質細胞以及骨細胞中，也發現了CFTR的表達。這些結果提示，CFTR在骨質維持中發揮一定的作用。最近，有研究對CFTR在骨代謝中的作用展開了進一步研究，發現在體外培養的成骨細胞中，CFTR蛋白特異性抑制后會下調OPG并上調PGE2的表達，提示CFTR可能直接在骨組織中發揮作用，影響骨形成和骨吸收的穩態[10,11]。因此，對骨組織中CFTR蛋白在維持骨代謝功能的深入研究，對于闡明CF骨病的發生具有重要意義。本研究利用Real time PCR和Western Blot的方法，研究體外培養的人破骨細胞中CFTR的表達，并以人支氣管細胞系16HBE14為陽性參照。結果顯示，CFTR在人破骨細胞低表達，進而利用轉染技術，使破骨細胞高表達CFTR，且高表達CFTR促進了破骨細胞的凋亡。

研究表明，Fas/FasL途徑在細胞凋亡過程中起著十分重要的作用。它是TNF家族成員中，凋亡機制涉及范圍最廣泛的一條死亡相關受體通路。Fas是屬于TNF受體（TNFR）家族的一種膜受體，其配體FasL（CD95L）屬于TNF家族[12]。我們利用Real-time PCR和Western Blot法檢測過表達CFTR后破骨細胞中Fas/FasL的表達，結果顯示：轉染組凋亡相關蛋白Fas及FasL的表達，無論是mRNA水平還是蛋白水平，較對照組及空白轉染組，均表達升高。總之，本研究初步發現CFTR通過促進Fas/FasL的高表達，進而促進破骨細胞凋亡。