注射器和酵母菌液在“pH影響過氧化氫酶活性”實驗中的應用

張 粒

(浙江省寧波北侖泰河中學 寧波 315800)

1 引言

“影響酶活性的因素”是浙科版高中生物學必修1《分子與細胞》中第一個探究實驗，是引導學生進行探究性學習、發展科學思維的好材料。浙科版、蘇教版、人教版在“探究pH對酶活性影響實驗”的酶種選擇上都采用過氧化氫酶，浙科版建議以豬肝研磨液作為過氧化氫酶的來源，采用排水集氣法測定單位時間內產生氣體的體積定量分析過氧化氫酶活性。是否能改進裝置，使操作更簡便，同時可定量且同步測定不同pH條件下過氧化氫酶的活性；能否優化實驗設計，深入探討過酸或過堿對過氧化氫酶活性有何影響。筆者結合教學實踐，進行了如下改進。

2 實驗方法與優化

2.1 裝置優化——兩通注射器 50 mL注射器兩支，通過兩通管連接，一支注射器加入酶溶液，另一支加入H2O2溶液；將H2O2溶液注射到酶溶液中，反應開始記錄單位時間內注射器中氣體的變化量作為酶活性的檢測指標。改進后的裝置使反應發生和定量測定在同一個注射器中進行，操作更簡便，數據更易獲得，同時可以定量控制酶和底物的用量。裝置的氣密性檢測可通過一支注射器活塞拔出5 mL，組裝成兩通注射器后浸沒在水面之下，推動活塞將注射器中氣體推入另一支，此過程若無氣泡產生，即裝置氣密性良好。

圖1 改進的實驗裝置兩通注射器

2.2 材料優化——單細胞真菌酵母 為解決傳統實驗材料鮮肝勻漿和馬鈴薯勻漿的制備過程中需要研磨、保存不便的弊端，以及多細胞生物內環境中pH緩沖對可能引起的對實驗變量的干擾，聯想到酶的發現史中早期酶的研究是從釀酒酵母開始，因此選擇安琪干酵母粉，用蒸餾水配制2%酵母溶液備用(不使用葡萄糖溶液配制是為防止酵母自身呼吸作用產生的CO2影響因變量的檢測)，酵母菌作為單細胞生物，不存在內環境中pH緩沖對，可減少對自變量設置的干擾；同時酵母菌中過氧化氫酶含量和活性都大大超過鮮肝，效果理想，反應迅速。

2.3 pH緩沖液范圍及處理優化 H2O2對酸堿度變化(特別是堿性條件下)相比溫度升高更敏感[1]，隨著pH的增大，H2O2自分解明顯加快，而酸性環境中H2O2較穩定。為此，用Na2HPO4-檸檬酸緩沖液(0.2 mol/L Na2HPO4和0.1 mol/L檸檬酸)作為母液，并減少堿性pH梯度的設置，利用筆式酸度計調節pH4.0、pH5.0、pH6.0、pH7.0、pH8.0五個梯度，將2%酵母溶液和4% H2O2同時調節至相應pH。

2.4 定量實驗設計優化 將對應pH處理的4%H2O2溶液和2%酵母溶液各4 mL加入到注射器中，搭建好裝置，利用裝置同步向對應酵母菌溶液中推入H2O2，記錄1 min、2 min、3 min注射器內O2變化量，統計O2平均釋放速率(mL/min)，以實現pH對過氧化氫酶活性影響的探究。

將pH4.0和pH8.0處理的酵母菌溶液恢復到適宜的pH條件，催化效率會變化嗎？基于學生提出的問題，利用該裝置設計將緩沖液pH4.0和pH8.0處理酵母菌溶液后再恢復至上個實驗中酵母過氧化氫酶活性較高的pH6.0條件，以探究過酸或過堿處理對酶活性的不同影響。

3 實驗結果

3.1 pH對酵母菌過氧化氫酶活性的影響實驗 pH對過氧化氫酶活性影響明顯(表1)，隨著pH增大，酶活性先增強后減小，pH6.0時酵母菌中過氧化氫酶活性較強(圖2)。

3.2 過酸或過堿處理對酵母菌過氧化氫酶活性的影響 當pH4.0和pH8.0處理的酵母菌過氧化氫酶恢復至最適pH，催化H2O2分解產生O2的速率(表2)并未明顯提升(圖3)，由此可知過酸、過堿使酶不可逆地部分失活。

4 討論

本實驗也有類似裝置的研究成果發表，如利用塑料軟泡做反應室與注射器相連制作定量測定裝置[2]，或用注射器吸取過氧化氫酶，用針頭扎穿試管塞使反應在試管中發生[3]。筆者認為其都有一弊端： 反應室與集氣室的分離會導致劇烈反應產生的氣泡堵住連接處而引起集氣量的誤差，而本實驗中反應室與集氣室在同一注射器中進行，另一注射器由于隔板的固定作用而活塞無法移位，這樣大大減少集氣誤差。本裝置的適用性和實用性較廣，在酶實驗中涉及酶的專一性、高效性的探究，甚至包括不同酶濃度和不同底物濃度對反應速率的影響均可以使用該裝置，實現一裝置，多用途。傳統材料的摒棄，取而代之是市售干酵母，排除自身pH緩沖對的干擾，也更加簡便，成本低廉，實驗效果和效率都能大幅提升,使“影響酶活性的因素”的探究在一節課中完成變為可能；也有教師用固定化技術固定酵母[4]或用濾紙片固定肝臟研磨液中過氧化氫酶[5]，同樣也可達到較理想的效果。在pH緩沖液設置中避免強堿對H2O2自分解的影響，選用較低濃度4%H2O2溶液，且pH梯度設置在較為合理的pH4.0～pH8.0范圍；在教材實驗基礎和學生的質疑中優化方案，嘗試探究了過酸、過堿處理的酶恢復至最適pH后酶活性的差異，更直觀有效地說明過酸、過堿使酶失活。

表1 不同pH下酵母菌中過氧化氫酶催化H2O2產生O2的速率

A. 3 min時注射器體積

B. 不同pH下過氧化氫酶的催化反應速率

緩沖液調節的2%酵母菌溶液(4mL)pH4.0pH4.0恢復至pH6.0pH6.0pH8.0恢復至pH6.0pH8.04%H2O2溶液(mL)44444“酶”注射器中O2變化量(mL)1min5610762min10122213143min1617322322O2的釋放速率(mL/min)1min5610762min56116.573min5.35.710.77.77.3O2的釋放速率-平均值(mL/min)5.15.910.67.16.8

A. 3 min時注射器體積

B. pH恢復后過氧化氫酶的催化反應速率