H型高血壓合并腦梗死患者ALDH2基因多態性與Hcy代謝、炎性反應及氧化應激狀態的相關性

劉春苗，楊國帥，鐘偉，余丹

急性腦梗死是臨床常見的腦血管疾病，而H型高血壓即血同型半胱氨酸(Hcy)水平≥10 μmol/L的高血壓，是急性腦梗死發生的重要危險因素[1-2]，但關于H型高血壓合并急性腦梗死發生的調控機制仍未明確。乙醛脫氫酶2(ALDH2)是ALDH家族19個成員中催化活性最強的成員，能夠將乙醇代謝產物乙醛脫氫氧化為乙酸，在乙醇的代謝過程中起到關鍵作用。近年來關于ALDH2的研究認為，該代謝酶不僅參與乙醇的代謝，還與體內Hcy、膽固醇等多種物質的代謝有關，其催化活性發生改變會增加代謝性疾病的發生風險[3-4]。ALDH2基因編碼第487位氨基酸的密碼子存在多態性，從鳥嘌呤(G)突變為腺嘌呤(A)后會改變ALDH2的催化活性，國內王洪巨等[5]報道，ALDH2基因G487A突變會增加冠心病合并糖尿病患者高血壓的發生風險，但關于ALDH2基因G487A突變與H型高血壓合并腦梗死的關系尚未明確。現分析 H型高血壓合并腦梗死患者ALDH2基因多態性及其與Hcy代謝、炎性反應、氧化應激狀態的相關性，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2016年6月—2018年2月海口市人民醫院神經內科診治高血壓合并急性腦梗死患者106例作為研究對象，根據入組時Hcy水平分為觀察A組(Hcy<10 μmol/L)42例、觀察B組(Hcy≥10 μmol/L)64例，另取同期于醫院體檢的健康者50例作為健康對照組。觀察A組42例，男24例，女18例，年齡44～65(54.48±7.63)歲；發病至入院時間3～12(5.51±0.83)h；高血壓病史1～8(4.23±0.73)年；合并糖尿病17例，高脂血癥23例；既往接受阿司匹林治療26例、他汀類藥物治療21例。觀察B組64例，男35例，女29例，年齡42～67(55.12±8.61)歲；發病至入院時間4～13(5.83±0.91)h；高血壓病史1～11(4.42±0.72)年；合并糖尿病24例，高脂血癥29例；既往接受阿司匹林治療38例，他汀類藥物治療32例。健康對照組50例，男28例，女22例，年齡40～65(53.94±8.42)歲。3組性別、年齡比較差異均無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經醫院倫理委員會批準，入選者和/或家屬同意并簽署知情同意書。

1.2 選擇標準 (1)納入標準：①經頭顱磁共振及彌散加權像診斷為急性腦梗死；②既往有高血壓病史；(2)排除標準：①既往有腦梗死、腦出血等病史的患者；②合并冠心病、自身免疫性疾病、惡性腫瘤的患者；③正在服用葉酸、維生素B12等影響Hcy代謝的藥物的患者。

1.3 觀察指標與方法

1.3.1 ALDH2基因多態性檢測：入院次日或體檢當日清晨取受試者靜脈血2 ml枸椽酸鈉抗凝，Ficoll淋巴細胞分離液分離白細胞，使用基因組DNA提取試劑盒提取DNA。目的DNA片斷擴增引物：上游引物5' -GTCAACTGCTATGATGTGTTTGG-3'，下游引5' -CCACCAGCAGACCCTCAAG-3'。反應體系50 μl：模板DNA 2 μg、2XMaster Mix 25 μl、引物各2 μl、雙蒸水補足至50 μl。反應條件：94℃預變性3 min后進入循環 94℃變性45 s，60℃退火30 s,72℃延伸45 s，共35個循環，最后72℃延伸5 min，4℃保存。PCR擴增產物為200 bp。擴增產物在2%瓊脂糖凝膠中進行電泳，溴乙啶染色，紫外線分析凝膠成像系統下觀察電泳結果。將目標條帶切下，使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒將PCR產物純化，由濟南博亞生物技術有限公司提供目的基因片段測序，判斷ALDH2的多態性。

1.3.2 Hcy代謝、炎性反應及氧化應激血清指標檢測：觀察A組、觀察B組患者于入院后采集肘靜脈血，健康對照組于體檢時采集肘靜脈血，離心分離血清，-80℃備用。(1)Hcy代謝指標：采用酶循環法試劑盒(北京世紀沃德生物公司)測定Hcy含量，采用酶聯免疫吸附試劑盒(上海西唐生物公司)測定葉酸(FA)及VitB12含量。(2)炎性反應指標：采用酶聯免疫吸附試劑盒(上海西唐生物公司)測定白介素-6(IL-6)、IL-8含量。(3)氧化應激指標：采用硫代巴比妥酸法試劑盒(南京建成生物研究所)測定丙二醛(MDA)含量，采用比色法試劑盒(南京建成生物研究所)測定總抗氧化能力(T-AOC)含量。操作步驟均嚴格按照試劑盒說明書進行。

2 結 果

2.1 ALDH2基因G487A多態性比較 健康對照組ALDH2基因野生型GG的構成比為84.0%(42/50)、突變型GA+AA基因型的構成比為16.0%(8/50)；觀察A組分別為61.9%(26/42)、38.1%(16/42)；觀察B組分別為37.5%(24/64)、62.5%(40/64)。與健康對照組比較，觀察A組和觀察B組患者ALDH2基因GG的構成比明顯較低、GA+AA構成比明顯較高(χ2/P=5.779/0.016、24.899/0.000)；與觀察A組比較，觀察B組患者ALDH2基因野生型GG的構成比明顯較低、突變型GA+AA的構成比明顯較高(χ2/P=6.061/0.014)。

2.2 血清Hcy、FA、VitB12含量比較 與健康對照組比較，觀察A組和觀察B組患者血清Hcy含量均明顯升高，FA、VitB12含量均明顯降低(P<0.01)；與觀察A組比較，觀察B組患者的血清Hcy含量明顯升高，FA、VitB12含量均明顯降低(P<0.01)，見表1。

2.3 血清炎性反應及氧化應激指標比較 與健康對照組比較，觀察A組和觀察B組患者的血清IL-6、IL-8、MDA含量均明顯升高，T-AOC含量均明顯降低(P<0.01)；與觀察A組比較，觀察B組患者的血清IL-6、IL-8、MDA含量明顯升高，T-AOC含量明顯降低(P<0.01)，見表2。

2.4 觀察B組不同ALDH2基因型患者血清Hcy代謝、炎性反應及氧化應激指標比較 與觀察B組ALDH2基因GG基因型比較，GA+AA基因型患者的血清Hcy、IL-6、IL-8、MDA含量均升高，FA、VitB12、T-AOC含量均降低。見表3、4。

3 討 論

H型高血壓是急性腦梗死發生的重要危險因素，Hcy含量的升高以及血壓的升高參與了顱內動脈粥樣硬化的進程并增加了腦梗死的發生風險[6]。ALDH2是參與乙醇代謝的催化酶，近年來也發現該催化酶與膽固醇、Hcy等物質的代謝有關。ALDH2基因在G487A位點的多態性會影響其催化活性，國內學者的研究報道，ALDH2基因編碼第487位氨基酸的密碼子發生G向A的突變會使編碼產物的催化活化發生改變，進而參與多種代謝性疾病及心腦血管疾病的發生[7-8]。本研究首先分析了高血壓合并腦梗死患者體內ALDH2基因G487A多態性的變化，觀察A組和B組患者的野生型GG的構成比明顯降低、突變型GA+AA的構成比明顯升高，這一結果與報道的在冠心病及心肌梗死患者中的研究結果一致，本研究結果表明ALDH2基因G487A突變的增多與高血壓合并腦梗死的發生有關。在此基礎上進一步分析H型高血壓合并腦梗死患者與普通高血壓合并腦梗死患者ALDH2基因G487A多態性的差異，合并H型高血壓的觀察B組患者野生型GG的構成比明顯降低、突變型GA+AA的構成比明顯升高，提示ALDH2基因G487A突變的增多可能影響Hcy代謝并參與H型高血壓合并腦梗死的發生。

表1 3組受試者血清Hcy、FA、VitB12含量比較

表2 3組受試者血清炎性反應及氧化應激指標比較

表3 觀察B組中不同ALDH2基因型患者Hcy、FA、VitB12含量比較

表4 觀察B組中不同ALDH2基因型患者炎性反應及氧化應激指標的比較

Hcy是體內甲硫氨酸代謝循環中的產物，FA和VitB12是Hcy代謝所需的輔因子[9-11]，H型高血壓以體內Hcy的增多為特征，有研究表明，當患者體內Hcy代謝所需的輔因子缺乏時，Hcy代謝受阻并在體內蓄積，進而通過誘導炎性反應、氧化應激反應等造成動脈內皮損傷、粥樣斑塊形成并參與腦梗死的發生[12-14]。本研究對H型高血壓合并腦梗死患者體內Hcy代謝情況的分析發現：觀察B組患者的血清Hcy含量均明顯高于觀察A組和健康對照組，FA和VitB12含量均明顯低于觀察A組和健康對照組，這一結果與國內相關報道一致，提示Hcy代謝所需輔因子的減少、Hcy在體內的蓄積參與了H型高血壓合并腦梗死的發生[12-13]。在此基礎上，為了進一步明確ALDH2基因多態性在H型高血壓合并腦梗死患者體內Hcy代謝過程中所起的作用，本研究分析了觀察B組中不同ALDH2基因型患者體內Hcy代謝指標的差異，突變型GA+AA患者的血清Hcy含量明顯高于野生型GG患者，FA和VitB12含量均明顯低于野生型GG患者，提示ALDH2基因G487A突變的增多能夠影響Hcy的代謝，進而通過Hcy的生物學特性參與H型高血壓合并腦梗死的發生。

Hcy具有誘導炎性反應及氧化應激反應的作用，炎性反應激活過程中產生的炎性反應介質以及氧化應激反應激活過程中產生的氧自由基能夠引起血管內皮損傷、粥樣斑塊形成，與腦梗死的發生密切相關[15-18]。IL-6和IL-8是重要的炎性反應介質，具有強大的促炎活性，能夠促進炎性反應細胞在血管內膜浸潤并形成粥樣斑塊[19-21]；MDA是氧自由基與內皮細胞膜中脂質成分發生氧化反應的產物，T-AOC則是抗氧化的總能力，兩者共同反映了氧化應激的程度[22-23]。本研究對H型高血壓合并腦梗死患者體內炎性反應及氧化應激反應指標的分析發現，觀察B組患者的血清IL-6、IL-8、MDA含量明顯高于觀察A組和健康對照組，T-AOC含量明顯低于觀察A組和健康對照組，提示炎性反應及氧化應激反應的過度激活參與了H型高血壓合并腦梗死的發生。在此基礎上，為了進一步明確ALDH2基因多態性在H型高血壓合并腦梗死患者體內炎性反應及氧化應激反應激活中所起的作用，本研究分析了觀察B組中不同ALDH2基因型患者體內炎性反應及氧化應激指標的差異，突變型GA+AA患者的血清IL-6、IL-8、MDA含量均明顯高于野生型GG患者，T-AOC含量均明顯低于野生型GG患者，提示ALDH2基因G487A突變的增多能夠造成炎性反應和氧化應激反應的過度激活。

綜上所述，ALDH2基因G487A突變與H型高血壓合并腦梗死的發生及Hcy代謝紊亂、炎性反應及氧化應激過度激活有關。

利益沖突：無

作者貢獻聲明

劉春苗：負責研究構思，選擇課題，課題設計，論文撰寫；楊國帥、鐘偉：負責數據獲取，統計分析并參與撰寫；余丹：負責研究方案指導，論文修改