阿托伐他汀對2型糖尿病心肌病大鼠心肌纖維化、炎性因子及脂聯素的作用研究

王珣，江巍，張磊，陳緒江，董曙光，張遠恒

糖尿病心肌病作為常見的糖尿病并發癥，是引發心臟意外的主要原因[1-2]。研究發現，糖尿病心肌病病理過程主要顯示為在長時間高糖刺激作用下，心肌細胞微環境出現能量代謝紊亂、炎性反應及氧化應激激活，并不斷出現心肌纖維化、心肌重構，對生命健康存在嚴重危害[3]。目前，臨床醫學針對糖尿病心肌病多以控制血糖及糾正慢性心力衰竭治療為主，但難以明顯控制病情進展。研究發現，表皮生長因子受體(EGFR)對糖尿病心肌病患者的心肌纖維化發展存在促進作用，將EGFR作為靶點尋找新型藥物治療糖尿病心肌病為臨床研究重點[4]。近年來，研究發現他汀類藥物可對炎性反應進行抑制，改善患者內皮功能，減少心血管不良事件發生率[5]。基于此，本研究對阿托伐他汀對2型糖尿病心肌病大鼠心肌纖維化、炎性因子及脂聯素的作用進行分析，探討其作用機制，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)動物：清潔級的雄性Wistar大鼠60只(3個月齡)，體質量180～200 g，由醫院實驗中心提供，所有大鼠飼養于清潔級動物房中，恒溫(20℃)、恒濕(40%)環境飼養；(2)試劑與藥物：鏈脲佐菌素(STZ)購自美國Sigma公司；阿托伐他汀購自輝瑞制藥有限公司；EGFR抗體購自SANTA CRUZE公司；(3)儀器設備：GA-7型血糖儀(長沙三諾生物傳感技術有限公司),OPJ-1B型切片機(天津天利航空機電有限公司)，AU2700型全自動生化分析儀(日本OLYMPUS公司)，IX71型顯微鏡(日本OLYMPUS公司)。

1.2 實驗方法 2018年3月—2018年7月在武漢大學附屬同仁醫院動物實驗室進行實驗。雄性大鼠60只，隨機選擇20只作為空白對照組(A組)，給予普通飼料喂養30 d，而后經腹腔注射體積相同的枸櫞酸緩沖液；余40只大鼠納入研究組，每日給予高糖、高脂肪食物喂養(即于常規飼料內加入20%豬油、10%蔗糖)30 d，而后經腹腔注射小劑量STZ(30 mg/kg，溶入濃度為0.1 mol/L的枸櫞酸緩沖液內)，14 d后大鼠斷尾取血檢測血糖水平，血糖水平≥22 mmol/L即糖尿病大鼠模型成功；在此基礎上將40只大鼠隨機分成糖尿病模型組(B組)、阿托伐他汀組(C組)各20只；C組大鼠在成模后第2日給予阿托伐他汀20 mg· kg-1·d-1灌胃，持續治療2個月。而A組、B組大鼠則給予等體積的飲用水進行灌胃。

1.3 觀察指標與方法 在實驗結束時(造模后2個月)使大鼠空腹12～14 h，尾部取血3 ml，離心機離心取上清液待測。

1.3.1 血糖及血脂檢測：采用血糖儀檢測空腹血糖(GLU)水平；全自動生化分析儀檢測血清總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、脂聯素，所有操作全部參照試劑盒說明書執行，相關試劑盒均由北京奧維亞生物技術有限公司提供。

1.3.2 血清、心肌炎性因子檢測：采用放射免疫法檢測血清和心肌白介素-6(IL-6)、C-反應蛋白(CRP)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)，所有操作全部參照試劑盒說明書執行，相關試劑盒均由碧云天生物技術研究所提供。

1.3.3 心肌組織檢測：

1.3.3.1 心肌脂聯素和炎性因子檢測 采用酶聯免疫吸附法檢測心肌脂聯素水平，所有操作全部參照試劑盒的說明書執行。

1.3.3.2 心肌組織病理學特點 取出大鼠心臟進行固定及脫水、石蠟包埋、切片，以Masson染色，于顯微鏡下對心肌纖維細胞分布情況進行觀察，用圖像分析軟件對心肌間質膠原的面積進行測定，并對心肌膠原容積分數(CVF)進行計算[6]：CVF=視野內膠原面積/心肌總面積×100%。

1.3.3.3 心肌組織EGFR蛋白檢測 采用Western Blot法[7]檢測心肌組織內EGFR蛋白，即心肌組織蛋白的提取物通過10% SDS-PAGE電泳分離后，轉移到硝酸纖維素膜上，脫脂奶粉封閉12 h，后用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)洗膜3次，再加入一定量的抗EGFR抗體，于37℃環境下孵育2 h；再經PBS溶液沖洗，后加入一定量的二抗，于室溫條件下孵育40 min，經PBS沖洗，用ECT顯色曝光，并經膠片顯影。參照目的條帶相關光密度值，對目的蛋白表達情況進行判定。

2 結 果

2.1 3組大鼠血糖及血脂水平比較 GLU、TC、TG水平比較，B組>C組>A組，差異均有統計學意義(P<0.01)，見表1。

表1 3組大鼠的血糖、血脂水平比較

2.2 3組大鼠血清、心肌組織炎性因子比較 大鼠血清、心肌組織IL-6、CRP、TNF-α水平B組>C組>A組(P<0.01)，見表2、3。

表2 3組大鼠血清炎性因子表達水平比較

表3 3組大鼠心肌炎性因子表達水平比較

2.3 3組大鼠血清、心肌組織脂聯素比較 血清脂聯素水平A組(2.7±0.4)ng/ml>C組(1.2±0.3)ng/ml>B組(0.6±0.2)ng/ml，差異均有統計學意義(q/P=8.164/0.000、14.472/0.000、8.125/0.000)。心肌組織脂聯素水平A組(1.6±0.2)ng/ml>C組(0.9±0.1)ng/ml>B組(0.5±0.1)ng/ml，差異均有統計學意義(q/P=7.704/0.000、12.346/0.000、6.328/0.000)。

2.4 心肌形態學比較 A組心肌纖維未發生病變，B組大鼠的心肌纖維細胞顯示為藍色，增生顯著，且排列紊亂，相互連接形成網狀，C組心肌纖維病變改善明顯；B組CVF(13.3±2.1)%高于C組(8.6±1.7)%高于A組(3.5±0.6)%，差異均有統計學意義(q/P=7.425/0.000、9.426/0.000、6.138/0.000)。圖1見封3。

2.5 3組大鼠心肌組織EGFR蛋白表達水平比較 大鼠心肌組織內EGFR蛋白光密度值B組>C組>A組 [(4.2±0.8)>(2.3±0.7)>(1.4±0.4)]，差異均有統計學意義(q/P=9.126/0.000、10.218/0.000、6.425/0.000)。

3 討 論

近年來，隨著臨床醫學深入研究發現，亞臨床炎性反應在糖尿病心肌病發生、進展過程中起到重要作用[8]，而炎性反應伴發大量的細胞因子、急性時相蛋白釋放，如IL-6、CRP、TNF-α等[9]。研究顯示，CRP為獨立于三酰甘油、BMI及纖維蛋白原(FG)的重要DM預測指標，而TNF-α多由激活后的單核巨噬細胞系統釋放，相關研究發現骨骼肌細胞及脂肪細胞等多數非免疫細胞均能釋放TNF-α，且TNF-α能經多種途徑誘發糖尿病，故TNF-α為導致胰島素抵抗的關鍵致病因子之一[10-11]。

脂聯素是脂肪細胞釋放的蛋白，具有多種主要的生理功能，如改善糖脂代謝、胰島素抵抗；降低肥胖患者的體質量；保護心肌細胞[12]；抑制血管細胞的黏附分子、細胞間相關黏附分子在主動脈內皮細胞表達，阻止動脈粥樣硬化；抑制巨噬細胞的前體細胞生長，將成熟巨噬細胞相關功能阻斷，調節炎性反應[13]。研究發現，針對體外培養的成纖維細胞、心肌細胞，脂聯素能發揮抑制TNF-α表達、抗凋亡作用，并且相關研究表明脂聯素和2型糖尿病、肥胖及胰島素抵抗的產生、進展存在密切相關性，故脂聯素表達能作為2型糖尿病心肌病發生的獨立危險因素[14-15]。本研究結果表明，糖尿病模型組大鼠的血清、心肌組織IL-6、CRP、TNF-α水平明顯高于空白對照組大鼠，脂聯素水平低于空白對照組；但阿托伐他汀組大鼠的血清、心肌組織IL-6、CRP、TNF-α水平明顯低于糖尿病模型組，脂聯素水平高于糖尿病模型組，提示炎性反應與糖尿病心肌病發生、進展存在密切關系，而阿托伐他汀能減少血清炎性因子釋放，增加脂聯素表達，緩解炎性反應。同時，本研究發現糖尿病模型組大鼠的血糖、血脂水平高于空白對照組，但經阿托伐他汀治療后，阿托伐他汀組大鼠的血糖、血脂、心肌纖維組織增生得到顯著改善，故認為阿托伐他汀能對2型糖尿病心肌病大鼠的心肌纖維化、血糖、血脂狀況進行改善，分析阿托伐他汀可能直接作用于大鼠的心肌組織[16]。

阿托伐他汀作為臨床調節血脂的常用他汀類藥物，其藥理機制主要為對3-羥甲基戊二酸單酰輔酶A(HMG-CoA)的還原酶活性進行抑制，使甲羥戊酸的合成減少，進而減少血LDL及TC表達水平。隨著臨床深入研究他汀類藥物發現，其于臨床防治心肌重構、冠心病及房顫等方面發揮重要作用，分析作用機制可能為抗炎、抗增殖及抗氧化應激[17]。研究顯示，他汀類藥物能對糖尿病心肌病進行改善，分析原因可能經對心肌細胞炎性反應及氧化應激進行抑制有關，但缺乏較多研究報道證實。EGFR作為跨膜蛋白受體，能經信號傳導系統準確地將細胞外信號快速轉送至細胞內，對細胞增殖存在促進作用[18]。有研究證實，EGFR于多種實體腫瘤細胞內呈高表達，而于正常的心肌組織內亦存在一定表達，其能將結締組織生長因子(CTGF)激活，發揮調節細胞增殖、遷移及凋亡作用，加快心肌纖維化[19]。本研究結果顯示，糖尿病模型組、阿托伐他汀組大鼠心肌EGFR蛋白表達顯著高于空白對照組，但阿托伐他汀組低于糖尿病模型組；提示EGFR蛋白在2型糖尿病心肌病發生、進展過程中發揮促進作用，應用阿托伐他汀治療能改善糖尿病心肌病大鼠的心肌纖維細胞增殖，其作用靶點可能是EGFR。

綜上所述，阿托伐他汀能有效防治2型糖尿病心肌病大鼠的炎性反應，調節脂聯素表達，緩解心肌纖維化程度，分析原因可能與阿托伐他汀減少心肌組織內EGFR蛋白的表達有關。

利益沖突：無

作者貢獻聲明

王珣：設計研究方案，整理、分析資料，撰寫論文；陳緒江：修改總指導；張遠恒：提出研究思維，分析數據，審批論文；董曙光：收集整理資料，查找參考文獻；江巍、張磊：實施研究過程