非小細胞肺癌組織中LCAL1的表達變化及意義

孟騰，徐美林

(1天津醫科大學，天津 300070；2天津市胸科醫院)

肺癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，從組織學上可分為小細胞肺癌(SCLC)和非小細胞肺癌(NSCLC)，其中后者占全部肺癌患者數的80%以上。肺癌患者5年生存率不足20%，雖然手術、化療、放療和阻斷表皮生長因子受體通路改善了NSCLC患者的預后，但晚期患者的生存率仍然很低[1,2]。早期診斷、早期治療和新靶向藥物的出現會大大提高NSCLC的存活率，因此研究NSCLC患者的潛在靶點對于提高生存時間和治療效果具有十分重要的意義，尋找新的肺癌診斷標志物成為當今研究熱點。lncRNA是一類轉錄本長度超過200個核苷酸(nts)的RNA分子，不編碼蛋白，參與多種生物的過程，包括染色質修飾、基因印跡、基因轉錄和選擇性剪接，其參與調控各種生物過程，如細胞增殖、分化、生長、運動、凋亡等[3～7]。近年來，lncRNA在腫瘤中的作用已經越來越引起臨床的關注。本研究觀察NSCLC組織中lncRNA LCAL1表達變化，分析LCAL1表達與NSCLC患者臨床病理參數、預后的關系，并探討其意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2014年1月～2016年6月天津市胸科醫院收治的NSCLC患者55例，男33例，女22例；TNM分期1期29例，2～4期26例，腫瘤直徑≤3 cm 31例，>3 cm 24例；組織病理類型為腺癌31例，鱗癌24例；23例有淋巴結轉移。所選患者術前均未行局部或全身放療或化療，均有完整的臨床和病理組織學資料，至少由2位病理學專家進行診斷。手術留取NSCLC組織及癌旁(距癌邊緣>5 cm)正常肺組織各55例份，所有組織樣本取下后立即液氮冷凍，隨后轉入-80 ℃冰箱保存。本次研究獲得天津市胸科醫院倫理委員會認可。

1.2 組織中LCAL1檢測方法 取50 mg凍存組織，磨成粉末狀，加TRIzol抽提RNA。按照說明書操作。組織中抽提RNA后，使用紫外分光光度計檢測其純度及濃度，取吸光度(A260/280)為1.8～2.0的RNA樣本，按逆轉錄試劑盒說明書將RNA樣本逆轉錄為cDNA，反應條件：30 ℃、10 min，95 ℃、5 min。采用VIIA7 DX實時熒光定量PCR儀分析，按照SYBR Green說明書配制反應總體系20 μL：2×SYRR Green 10 μL，ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μL，cDNA模板2 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL，RNase free ddH2O 6 μL。反應條件如下：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸34 s，共40個循環。PCR結束后，分析各孔的CT值(每個反應管內的熒光信號達到設定的閾值時所經歷的循環數)，用2-ΔCt和2-ΔΔCt分析LCAL1的相對表達量和表達倍數[8]。計算出標化后的2-ΔCt(其值越大，起始拷貝數越多)，ΔCt=樣本Ct均值-內參Ct均值，設對照組目的基因的量為1，則實驗組目的基因的量為對照組目的基因的量的2-ΔΔCt倍，ΔΔCt=[(樣本Ct目的基因一樣本Ct內參基因)-(對照組Ct目的基因-對照組Ct內參基因)]，以2-ΔΔCt代表目的基因的相對表達量，設定2-ΔΔCt≥1為陽性表達。

2 結果

2.1 NSCLC及正常肺組織中LCAL1表達比較 NSCLC及正常肺組織LCAL1表達水平分別為0.15(0.08，0.22)、0.05(0.016，0.14)，兩者比較，P<0.05。

2.2 組織中LCAL1表達與NSCLC臨床病理參數的關系 LCAL1表達與NSCLC臨床病理參數的關系結果見表1。

表1 LCAL1表達與NSCLC臨床病理參數的關系

注：由表1可知，LCAL1表達與NSCLC患者腫瘤直徑、淋巴結轉移、臨床分期有關(P均<0.05)。

2.3 組織中LCAL1表達與NSCLC患者預后的關系 按照LCAL1表達水平將NSCLC患者分為LCAL1高表達者(34例)和LCAL1低表達者(21例)，兩者中位生存時間分別為30個月、48個月，兩者比較P<0.05。

3 討論

肺癌作為全球最為常見的惡性腫瘤之一，近年來其發病率與病死率呈上升趨勢。女性肺癌發病率位于第4位，病死率位于第2位；男性其發病率占首位，同時也是導致男性惡性腫瘤死亡的重要原因[9,10]。肺癌最常見的病理類型是非小細胞肺癌，其預后相對于小細胞肺癌患者來說較好。有關調查研究顯示，NSCLC患者早期如果能夠得到確診的話，可以通過手術，放療和化療等治療方法獲得較好的預后，但是即便如此，NSCLC的總體5年生存率仍然很低，不足20%[11～13]。由于肺癌起病隱匿，早期患者的臨床表現并不典型，病癥顯現初期，肺癌患者的癥狀通常為非特異性，例如咳嗽、氣短、咳血或肺炎。隨著病情的進展，會出現陣發性刺激性嗆咳為特征的突發咳嗽，或長期頻繁的咳嗽，出現咳嗽性質的改變，但是一般不會咳出痰液或僅有少量白色泡沫樣痰咳出。此外，癥狀較輕且定位模糊的胸背痛、胸悶等癥狀也可能出現[14]。我國肺癌的診療技術已取得了很大的進步，從傳統的單一手術切除治療發展到現在的切除、放療與化療三者組合式聯合治療，再到通過對肺癌生物學機制的深入研究，發現新的生物學標記物和靶向治療的有效運用。各種調控基因在肺癌發生中起到十分關鍵的作用，復雜的、多步驟的轉移過程是由特異的基因產物與基因突變決定的。故探討肺癌發生發展的機制具有重要意義。

人類基因組包含約51 382個lncRNA基因，20 000～25 000個蛋白質編碼基因和約2 500個miRNA。許多lncRNAs表現出時空和組織特異性的表達模式，這表明lncRNAs的表達在組織發育和發病過程中都是程序化和高度調控的。在lncRNAs的核酸結構中，存在著與其他RNA(如mRNA和miRNA)結合的固有能力，這些RNA與lncRNAs或不完全或完全互補。lncRNA通過直接與mRNA相互作用，在mRNA剪接、編輯、亞細胞分布和穩定性調控中發揮關鍵作用[15]。雖然現在對于lncRNA的三維結構了解較少，但lncRNAs與蛋白質、DNA、RNA和金屬離子等其他分子相互作用，形成合適的三級結構來發揮其功能，這一點越來越明顯。lncRNA影響各種生物過程的潛在分子機制，包括染色質修飾、表觀遺傳調控、基因轉錄和翻譯、RNA轉換和基因組防御等，已被廣泛綜述[16]。lncRNA作為重要的調控因子，已成為腫瘤防治的研究熱點。LCAL1定位于染色體6q14.1，產生有三個外顯子轉錄本，在亞細胞定位中顯示了LCAL1在細胞核中富集。ENCODE數據庫顯示去氧核糖核酸酶和轉錄因子在LCAL1上游結合，提示LCAL1啟動子有調控活性。有研究[17]發現使用siRNA 1和siRNA 2敲除H322M和HCC95細胞系中的LCAL1，結果顯示細胞生長減少；在控制細胞系BEAS-2B中，穩定的過表達LCAL1，使用兩個不同的克隆，從第2天開始，到第6天實驗結束，細胞增殖活性增強。從上述實驗可得出LCAL1促進癌細胞的增殖。

本研究顯示，NSCLC組織中LCAL1表達水平高于配對癌旁正常組織，提示LCAL1可能與癌細胞的增殖有關。進一步分析發現，腫瘤直徑>3 cm的LCAL1陽性表達高于腫瘤直徑≤3 cm，可能的原因是腫瘤直徑可反映腫瘤負荷情況，LCAL1在腫瘤體積較大的患者中合成與釋放的更多；T2～T4期的LCAL1陽性表達高于T1期，提示NSCLC的惡性程度可能與LCAL1表達水平有關，LCAL1水平越高，NSCLC的惡性程度越高，猜測LCAL1參與了NSCLC的惡性轉化；組織LCAL1表達水平與淋巴結轉移情況有關，有淋巴結轉移者的LCAL1陽性表達相對較高，提示LCAL1可能參與了NSCLC的侵襲轉移過程。此外，LCAL1高表達者生存率顯著低于LCAL1低表達者，提示LCAL1陽性表達與NSCLC患者的預后不良相關，LCAL1可能調控腫瘤轉移和侵襲，提示其在預測NSCLC患者預后上有一定價值。

總之，LCAL1在肺癌組織中高表達，且與腫瘤直徑、淋巴結轉移和臨床分期及患者預后相關，可能在肺癌發生發展中有一定作用。但是，目前人們對于LCAL1肺癌的腫瘤細胞的生長、侵襲、增殖、分化、轉移和凋亡等具體調控機制的了解仍非常有限，更深層次的機制仍有待進一步的探索，盡管具體分子機制尚不清楚，但上述研究結果仍提示lncRNA LCAL1與NSCLC的發生發展有關，并有可能成為評估NSCLC患者預后的新的指標。