己酮可可堿灌胃對大鼠酒精性肝炎的治療作用及其機(jī)制探討

雷佳，王飛勇，田曉娟

(1巴彥淖爾市醫(yī)院，內(nèi)蒙古巴彥淖爾 015000；2包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院)

基金項(xiàng)目：包頭醫(yī)學(xué)院科學(xué)研究基金青苗計(jì)劃(H0315)。

通信作者：田曉娟(E-mail: txcookie@163.com)

酒精性肝炎(AH)是酒精性肝病(ALD)類型之一，屬于肝臟疾患早中期階段，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜多樣，目前機(jī)制尚不完全明確。AH發(fā)病率為10%～35%，30 d及1年病死率分別為15%、39%。重癥酒精性肝炎屬于AH特殊表現(xiàn)形式，其1年病死率可達(dá)60%[1～3]。AH發(fā)病比例高，目前認(rèn)為在此期進(jìn)行有效的干預(yù)手段如戒酒、合理膳食、藥物支持治療等，往往可阻止及逆轉(zhuǎn)肝臟和機(jī)體的繼續(xù)損害[4]；其中藥物治療還可對部分嗜酒并且戒酒依從性差A(yù)H患者有良好的治療作用，可抑制肝臟和機(jī)體進(jìn)一步損害，減慢肝臟疾病進(jìn)展，延長患者AH生存期。己酮可可堿(PTX)具有抗炎、抗肝纖維化、調(diào)節(jié)免疫等作用，是治療AH的一線藥物[5～8]，但目前PTX的具體作用機(jī)制在國內(nèi)外尚不明確。本研究觀察了PTX灌胃對大鼠AH的治療作用，并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼料 8周齡SPF級Wistar雄性大鼠30只，體質(zhì)量(180±40)g，購自內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[動(dòng)物許可證編號SCXK(蒙2015-0001)]；飼養(yǎng)環(huán)境：溫度(22±2)℃，濕度50%～60%；基礎(chǔ)飼料(由內(nèi)蒙古大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，高脂飼料(基礎(chǔ)飼料88%+豬油10%+膽固醇2%)。

1.2 PTX、白酒、試劑、儀器 PTX(純度>99%，購自北京索萊寶生物公司)；市售北京紅星二鍋頭56°白酒；ALT、AST購于羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司，10%中性緩沖甲醛固定液購于北京九州柏林生物科技有限公司，一抗過氧化物酶體增殖物受體α(PPAR-α)、NF-κP65及二抗快捷型酶標(biāo)羊抗鼠/兔IgG聚合物均購于Protech公司， DAB試劑盒購于上海邁新生物有限公司；羅氏501全自動(dòng)生化儀，病理切片機(jī)(型號LEICA RM2245)購于-上海芯超生物公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組、AH模型制備及PTX灌胃 按照前期預(yù)實(shí)驗(yàn)及參考相關(guān)文獻(xiàn)后，將大鼠隨機(jī)分為A、B、C各10只。A、B組給予高脂飼料， C組給予普通飼料。A、B組大鼠每日給予階梯式改良白酒灌胃法創(chuàng)建AH模型[9～11]，即1～3周灌胃30%乙醇5.0 g/(kg·d)，4～6 周灌胃40%乙醇6.0 g/(kg·d)，7～9周灌胃50%乙醇7.0g/(kg·d)，10～12周灌胃60%乙醇8.0 g/(kg·d),每日9︰00灌胃，1次/d；第9周始A組大鼠于每日15︰00灌胃9 mg/(kg·d)的PTX,B、C組灌胃等量生理鹽水，持續(xù)至12周末。

1.4 大鼠一般情況觀察 一般情況包含每天灌胃前后觀察大鼠精神狀態(tài)、步態(tài)、毛色、糞便情況,用電子秤測量大鼠體質(zhì)量。

1.5 大鼠血清AST、AT檢測 12周最后一次給藥后，30只大鼠禁食12 h，后依次按照組別腹腔注射10%水合氯醛0.35 g/kg麻醉處死，腹主動(dòng)脈取血2 mL于抗凝管內(nèi)，離心后采用全自動(dòng)生化儀檢測血清AST、ALT，操作嚴(yán)格按照試劑盒操作說明進(jìn)行，用國際臨床化學(xué)聯(lián)合會(IFCC)酶學(xué)參考法測量血清ALT，用谷草轉(zhuǎn)氨酶比色法測量血清AST。

1.6 大鼠肝臟組織觀察 取血后按組別處死大鼠，電子秤大鼠凈重稱重完畢后，迅速分離肝臟組織并將肝臟組織稱重，肉眼觀察肝臟組織。取肝左葉及右葉各切取2塊肝臟組織，10%甲醛固定，石蠟包埋并切片，常規(guī)HE染色，鏡下觀察，參照2014年AHHS病理[9]評分標(biāo)準(zhǔn)及ALD診療指南[10]。

1.7 大鼠肝臟組織PPAR-α、NF-κB蛋白檢測 將肝臟置于-80 ℃保存，取100 mg肝組織制備組織勻漿；提取組織蛋白及定量，再行SDS-PAGE(濃度10%)分離膠溶液，將處理好的樣品按照預(yù)定的順序加入濃縮膠的上樣孔內(nèi)，每張膠上加入10 μL的樣品量；電泳分離，轉(zhuǎn)移至PVD膜；將PPAR-α及NF-κB一抗加入不同標(biāo)記的PVDF膜上，將樣本膜正面，置于暗室，經(jīng)X線曝光后，顯影液將膠片顯影，置入清水中短暫漂洗后，定影，晾干保存，掃描圖像，用Image-Pro Plus Analysis Soft ware系統(tǒng)將目標(biāo)蛋白灰度圖像轉(zhuǎn)化為數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況比較 C組：大鼠行為敏捷，食欲好，毛發(fā)光滑，有光澤，大便性狀正常。B組：初始期灌入酒精后，5～20 min后出現(xiàn)醉酒癥狀，表現(xiàn)為步態(tài)不穩(wěn)、不喜動(dòng)、嗜睡等；2～4 h后，逐漸好轉(zhuǎn)；4周后出現(xiàn)酒精耐受情況，表現(xiàn)為醉酒狀態(tài)時(shí)間變短，部分甚至不表現(xiàn)醉酒癥狀；隨著酒精量不斷蓄積，在9周時(shí)大鼠出現(xiàn)毛發(fā)脫落，不喜吃食，大便為稀便；12周末更為嚴(yán)重，表現(xiàn)為毛發(fā)無光澤且粗糙，個(gè)別大鼠有脫毛后有皮膚裸露現(xiàn)象，厭食，大便干燥無光澤，呈淺灰色。A組：前9周表現(xiàn)與B組大鼠相同，9周后大鼠逐步出現(xiàn)食欲較前增加，大便成型，掉毛現(xiàn)象較前好轉(zhuǎn)，體質(zhì)量出現(xiàn)增長且緩慢。各組大鼠不同時(shí)點(diǎn)體質(zhì)量比較見表1。

表1 各組不同時(shí)點(diǎn)大鼠體質(zhì)量比較

2.2 各組血清ALT、AST水平比較 結(jié)果見表2。

表2 各組血清ALT、AST水平比較

注：與C組比較，*P<0.05；與B組比較，#P<0.05。

2.3 各組肝臟組織肉眼觀、鏡下觀比較 肉眼觀：C組肝臟質(zhì)地細(xì)膩，色澤紅潤，無黃色顆粒附著，無肝淤血； B組肝臟質(zhì)脆，易碎，色澤暗紅，且外表部分附有黃色油膩顆粒，肝淤血較重；A組僅有極少數(shù)肝臟有黃色顆粒附著，淤血情況較實(shí)驗(yàn)組輕。鏡下觀：C組無肝損傷；B組有肝臟損傷，且肝臟損傷程度最重；A組有肝臟損傷，但損傷程度較B組輕。

2.4 各組肝臟PPAR-α、NF-κB蛋白相對表達(dá)量比較 肝臟組織PPAR-α、NF-κB P65相對表達(dá)量比較見表3。

表3 各組肝臟組織PPAR-α、NF-κB P65蛋白相對表達(dá)量比較

注：與C組比較，*P<0.05；與B組比較，#P<0.05。

3 討論

ALD為常見的肝臟疾患之一，是由于慢性長期或一次性大量攝入酒精后，引起肝臟生理病理損害。隨著我國經(jīng)濟(jì)及社會發(fā)展，ALD成為繼乙型病毒性肝炎后第二大肝臟疾患，目前共分為五個(gè)階段[11～13]，AH屬于ALD的重要階段，在此階段的診治，會影響ALD疾病的演變及預(yù)后。目前，戒酒是最基礎(chǔ)的治療，終末期ALD時(shí)行肝臟移植在一定程度上可延長患者生存期，但由于肝源匱乏及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)重，故此治療很大程度局限性。所以藥物治療尤為重要，故探討PTX對AH的治療機(jī)制，對治療AH有著現(xiàn)實(shí)意義。

PTX是國內(nèi)外藥物治療AH中一線治療藥物之一，屬非選擇性磷酸二酯酶抑制藥，具有抗炎、抗免疫、抗內(nèi)毒素的作用，在多器官、多系統(tǒng)均有作用，被廣泛應(yīng)用于臨床。PTX以前主要應(yīng)用于心腦血管疾病治療，現(xiàn)在用于AH的治療中，并寫入了指南及教科書中[14,15]。目前研究[16,17]發(fā)現(xiàn)，PTX治療嚴(yán)重AH患者在一定程度上可減少肝腎綜合征的發(fā)生，明顯降低其病死率。本研究顯示，C組大鼠無機(jī)體及肝損害表現(xiàn)；A、B組大鼠機(jī)體一般情況、體質(zhì)量不及C組，且肝臟ALT、AST指標(biāo)高，肝臟均有不同程度的脂肪浸潤及炎性損傷；其中B組機(jī)體一般情況最差，且肝臟ALT、AST指標(biāo)及病理炎癥程度最重；A組藥物干預(yù)后，以上指標(biāo)有了一定改善，但其改善程度不及C組。

PPAR-α是一種配體活化的轉(zhuǎn)錄因子，屬于PPARs超家族一員，高表達(dá)于脂肪酸B氧化水平高的器官—肝臟。在肝臟中可被激活上調(diào)。PPAR-α上調(diào)一方面可參與調(diào)節(jié)脂肪酸氧化和運(yùn)輸，在線粒體及β氧化活躍的肝臟中水平較多通過促進(jìn)脂肪分解[18,19]，另一方面可起到抗氧化及免疫作用，用來改善AH中的肝臟脂肪代謝紊亂，免疫應(yīng)答功能異常等作用。NF-κB是可引起肝臟炎癥、纖維化、肝細(xì)胞壞死及凋亡等作用的轉(zhuǎn)錄因子細(xì)胞，其下調(diào)可抑制TNF-α激活，使表達(dá)降低起到抗炎作用。由于NF-κB功能多樣，可作用于趨化因子、生長因子、細(xì)胞黏附因子及早期反應(yīng)的蛋白質(zhì)分子基因的轉(zhuǎn)錄，而參與炎癥和免疫反應(yīng)，故NF-κB在許多疾病中均有表達(dá)。NF-κB P65是NF-κb家族中的一員，其活性較強(qiáng)可使肝細(xì)胞缺血損傷加重，并促進(jìn)肝細(xì)胞凋亡和肝細(xì)胞腫瘤形成。在肝臟中NF-κB P65活性較強(qiáng)[20]，其激活會對AH的細(xì)胞凋亡調(diào)控機(jī)制起重要作用，可產(chǎn)生更多炎癥因子，參與肝纖維化的形成，進(jìn)一步加重肝臟損害，加速了AH病程的發(fā)展及演變。PPAR-α和NF-κB P65在眾多領(lǐng)域都有研究，因其抗炎、抗氧化、抗肝纖維化、調(diào)節(jié)脂肪代謝等作用，故與AH密切相關(guān)。目前在國內(nèi)外報(bào)道中，PTX在治療AH時(shí)，對肝臟保護(hù)機(jī)制的相關(guān)研究較少，所以PPAR-α和NF-κB P65機(jī)制研究對今后AH的臨床治療十分重要。本研究顯示，與C組比較，A、B組PPAR-α蛋白相對表達(dá)量降低，NF-κB P65蛋白相對表達(dá)量升高；與B組比較，A組PPAR-α蛋白相對表達(dá)量升高，NF-κB P65蛋白相對表達(dá)量降低。由此可推測，PPAR-α、NF-κB P65蛋白水平的增減與肝臟損害程度有關(guān)， PTX可能通過對PPAR-α和NF-κB P65水平的調(diào)控來治療AH。

總之，PTX可治療大鼠AH，其機(jī)制可能與上調(diào)PPAR-α表達(dá)和下調(diào)NF-κB P65表達(dá)有關(guān)。