BMSCs與VEGF 165-HUVEC局部皮下組織層共移植大鼠缺血皮瓣存活率觀察

明華偉，何蕓，付光新，李彪，甘升遠，邵學壘，夏德林

(1南充市中心醫院，四川南充 637000；2西南醫科大學口頜面修復重建和再生實驗室；3西南醫科大學附屬口腔醫院)

由于惡性腫瘤切除、創傷、嚴重感染及先天畸形等各種因素所致頜面部組織缺損，給患者身心帶來極大的負面影響，這使對創面進行修復以恢復患者的功能及外觀顯得尤為迫切。皮瓣移植應用于頜面部缺損的修復重建由來已久，其同時具有創面修復、功能重建等重要作用[1]。但有研究[2,3]報道，皮瓣移植術后部分壞死率達11.4%，完全壞死率為4.0%～6.3%；術后一旦出現皮瓣血運障礙、缺血壞死，臨床處理會非常棘手[4]。因此，如何提高缺血皮瓣的存活能力是修復重建外科一直以來研究的重點。血管生成是由血管內皮祖細胞原位聚集、增殖分化、發育成血管系統的一個需要多種細胞因子參與的復雜過程[5]。血管內皮生長因子(VEGF)及骨形態發生蛋白(BMP)在成骨及成血管方面發揮極為重要的生物學作用，骨髓基質干細胞(BMSCs)及臍靜脈內皮細胞(HUVEC)共培養后，兩者分泌的VEGF與BMP之間存在著相互促進、級聯放大的作用[6]。VEGF被認為是作用最直接、特異性最高的一種促血管化生長因子，其中VEGF 165在體內含量最為豐富，促血管化作用最強[7～10]。但VEGF在體內半衰期短，局部應用很快被周圍組織液稀釋。將VEGF 165基因導入HUVEC后再與BMSC共移植，在體內是否能夠持續釋放VEGF促進缺血皮瓣的血管生成以往鮮有報道。本研究通過制備大鼠背部缺血皮瓣模型，并移植BMSCs、VEGF 165基因修飾的HUVEC(VEGF 165-HUVEC)，觀察兩者共移植對缺血皮瓣存活能力的影響

1 材料與方法

1.1 實驗動物 6～8周齡雌性SD大鼠50只，體質量180～200 g；4周齡雄性SD大鼠2只，體質量250～300 g；均由西南醫科大學實驗動物中心提供。

1.2 HUVECs、pHBAd-MCMV-GFP-VEGF165及試劑、儀器 HUVECs(Sciencell公司)；pHBAd-MCMV-GFP-VEGF165(由漢恒生物科技公司包裝、構建及鑒定)；DMEM培養基、胎牛血清(HyClone公司)、EGM-2(Lonza公司)、血管內皮生長因子抗原、ELISA檢測試劑盒、兔抗大鼠CD31抗體(一抗)、羊抗兔IgG(二抗，碧云天生物科技有限公司)；倒置相差顯微鏡(奧林巴斯)。

1.3 BMSCs和HUVEC的培養、計數、定容 全骨髓貼壁培養法培養雄性SD大鼠股骨、脛骨骨髓。當細胞增殖達到90%融合時進行胰酶消化傳代，傳至第3代后制成單細胞懸液，離心后重懸細胞，計數、定容至1 mL培養液含1×106個BMSCs備用。從液氮容器中取出HUVECs，常規復蘇后將按比例接種、傳代。傳至第3代后制成單細胞懸液，離心后重懸細胞，同樣定容至1 mL培養液含1×106個HUVEC備用。

1.4 腺病毒介導VEGF-165基因轉染HUVEC第3代HUVEC 在前期體外實驗中[11]，我們通過VEGF 165-HUVEC的MOI摸索時發現，當MOI=30時為其最佳感染復數，故在本實驗中采用MOI=30進行基因轉染。參照病毒轉染說明書步驟操作，將腺病毒介導攜帶VEGF 165基因重組pHBAd-MCMV-GFP-VEGF165質粒轉染至HUVEC。

1.5 缺血皮瓣模型制備、分組及BMSCs和VEGF 165-HUVEC共移植 SD大鼠經10%水合氯醛0.3 mL/100 g腹腔麻醉，備皮后在大鼠背部設計隨意皮瓣(4.0 cm×1.5 cm)，并于皮瓣中軸線上等距離處標記三個注射點，銳性分離掀起皮瓣，再對位縫合，術后創口涂布紅霉素眼膏，無需敷料包扎。所有動物模型由同一組人員制備，大鼠術后分籠飼養。建模成功(缺血皮瓣制備手術過程順利，手術探查確認皮瓣無軸心血管，手術過程中及術后取材前未死亡，麻醉蘇醒后能正常活動)后所有大鼠隨機分為5組各10只，術后即刻在標記點(分別距離皮瓣遠蒂端1、2、3 cm處)皮下組織層移植等量細胞5×105個，A組移植BMSCs與VEGF 165-HUVEC(1∶1)，B組移植VEGF 165-HUVEC，C組移植BMSCs與HUVEC(1∶1)，D組移植HUVEC，E組注射等體積0.9%NaCl溶液。

1.6 皮瓣存活率測算 術后第11天，數碼相機對各組皮瓣拍照，采用 Image-Pro Plus 6.0軟件分析、計算各組皮瓣存活率(每組10只大鼠)，皮瓣存活率(%)=皮瓣總面積(cm2)-皮瓣壞死面積(cm2)/皮瓣總面積(cm2)。

1.7 大鼠血清VEGF蛋白檢測 于術后第2、4、7、14天采用經眼眶后靜脈叢采血法抽取大鼠外周血0.5～1.0 mL，離心取血清，采用ELISA法檢測血清中VEGF(第2、4、7天VEGF水平檢測時大鼠數為10只，第14天VEGF水平測定時大鼠數為5只)。

1.8 皮瓣微血管密度(MVD)測算 術后第11天，各組隨機抽取5只大鼠，麻醉過量處死后于皮瓣存活區域取材，行CD31免疫組化，檢測皮瓣MVD。在每組中隨機抽取10張切片，于200倍光鏡下每張隨機計算20個視野中的血管斷面數目，求均值計算各組皮瓣的MVD值[12]。皮瓣MVD(條/mm2)=第1個視野血管斷面數目(N1)+N2+、+N20/20。

2 結果

2.1 各組術后第11 天皮瓣存活率比較 A、B、C、D、E組皮瓣存活率分別為84.3%±4.7%、61.2%±4.5%、50.1%±3.8%、43.8%±2.9%、30.7%±1.9%，兩兩比較，P均<0.05。

2.2 各組不同時點血清VEGF蛋白水平比較 血清VEGF蛋白水平比較見表1。

組別 VEGF蛋白 術后第2天術后第4天術后第7天術后第14天 A組486.3±7.5?583.7±13.4?682.5±12.6?274.2±7.1?B組352.3±4.8435.2±6.9550.2±9.7215.5±5.8C組34.8±2.935.6±3.229.1±2.826.9±1.9D組33.1±2.031.2±3.727.9±2.824.7±2.1E組33.2±3.630.7±2.833.2±2.725.7±1.8

注：與其余4組比較，*P<0.05。

2.3 各組皮瓣局部MVD計數比較 A、B、C、D、E組MVD計數分別為62.1±5.2、53.7±4.8、40.5±3.1、25.9±3.0、17.8±1.1，兩兩比較，P均<0.05。

3 討論

口腔頜面部常因手術切除良惡性腫瘤、頜面部創傷、間隙感染及發育性畸形等各種因素所致組織缺損，從而導致面部畸形，嚴重影響患者的吞咽、言語等生理功能及日常生活，不可避免的給這類患者的身心健康造成較大的影響。臨床選用何種方法對組織缺損來進行修復重建，才能盡可能恢復較為正常的生理功能及面部外形顯得尤為迫切。皮瓣移植自應用于口腔頜面部軟組織缺損的修復重建以來，取得了較為滿意的臨床效果，其兼具創面修復、功能重建等重要作用。但是皮瓣移植后由于局部壓迫、血栓形成等各種復雜的局部或全身因素造成其血流動力學發生變化，最終導致皮瓣因缺血而發生局部或全部壞死。皮瓣移植術后一旦出現血運障礙、缺血壞死，臨床處理較為棘手，往往需再次或多次手術，增加了患者的創傷及醫療費用，如何提高缺血皮瓣的存活能力一直以來是臨床研究的重點和難點。

BMSCs是一種存在于骨髓中的非造血干細胞，具有自我復制及多向分化的干細胞潛能，在體外特定的誘導環境中可以向成骨細胞、脂肪細胞、血管內皮細胞等方向分化，經體外培養后不影響其增殖、分化能力。HUVEC來源豐富,取材、操作方便,不像胚胎干細胞涉及安全性及倫理學問題，且具有干細胞的功能-能夠無限次(理論上)增殖傳代。VEGF已被公認為是在血管生成中發揮重要作用的促血管化生長因子，包括五種異構體，其中VEGF 121和VEGF 165兩種蛋白質是主要的分泌成分和效應因子[13,14]。而VEGF 165在體內含量最為豐富，促血管化作用最強[15]。國內外學者利用VEGF促血管化研究的實施方案包括對其進行蛋白重組和基因轉染這兩種形式。但是經過蛋白重組后的VEGF應用于體內實驗研究時發現，其半衰期非常短，很快就會溶解于周圍組織液當中并降解而失去生物學活性，無法持續、穩定地發揮促血管生成的作用；通過血液循環途徑不能精準定位至損傷局部發揮作用，且需要多次給藥，不可避免地增加了經濟負擔。近年來，大多數學者將目光投向基因轉染這個方式，通過將目的基因導入宿主細胞后讓自身源源不斷的合成效應蛋白，從而能夠在體內持續發揮促血管生成的生物學效應[16]。應用HUVEC與BMSCs共培養體系時，利用它們之間分泌的細胞因子在生物學功能方面產生偶聯協同效應，加速血管生成，相互促進，相互影響。本研究顯示，各組皮瓣存活率兩兩比較有差異，且A組皮瓣成活質量明顯高于其他四組。

有研究發現[17]，BMSCs與HUVEC在共培養條件下，除HUVEC自身能夠分泌VEGF 165外，還能增加BMSCs合成和分泌VEGF 165，兩者分泌的VEGF 165共同促進了HUVEC的分裂、增殖、遷移以及血管芽的形成。本研究顯示，A組VEGF蛋白表達水平并未明顯升高，C、D、E組各時間點的VEGF水平波動較小。我們分析，出現這種現象的原因可能是由于HUVEC和BMSCs自身能分泌多種促血管化生長因子，如VEGF、bFGF、PDGF等，這些促血管化因子通過一系列復雜的生物學效應發揮了血管生成的作用，一定程度上提高了皮瓣存活率，但是這些促血管化生長因子的量較少，在全身血液循環過程中被稀釋。而本實驗經大鼠眼眶后靜脈叢采血離心后檢測VEGF水平，其局部產生的VEGF蛋白經全身血液循環至眼眶后靜脈時已被大量稀釋，C、D組皮瓣局部實際的VEGF水平應該明顯高于實驗檢測的結果。比較B、D組的VEGF蛋白水平，我們發現轉染基因的HUVEC在體內能持續高表達VEGF蛋白，結合兩組相應的皮瓣存活率及MVD表明，VEGF發揮了促血管生成的作用；A組皮瓣存活率高于B、C組，轉染基因的HUVEC與BMSCs共移植后VEGF表達水平明顯高于單獨共移植或單獨轉染基因，A、B、C組皮瓣MVD數據比較同樣印證該結果。有研究[18]發現，在BMSCs與HUVEC共培養體系中，HUVEC分泌的尿激酶類纖容酶原激活劑(uPA)和VEGF受體增加，同時BMSCs中VEGF 165的表達也上調，VEGF 165進而活化HUVEC中uPA，uPA與血管內皮鈣粘蛋白可能一起啟動了共培養細胞的自組裝進網絡以及細胞的遷移、增殖、分化。Kaigler等[19]發現，在BMSCs與血管內皮細胞共培養體系中，BMSCs能分泌VEGF來促進內皮細胞的分裂、增殖分化形成血管芽狀結構。還有研究發現[20～23]，共培養的VECs可以釋放BMP-2，一方面促進成骨分化，另一方面還可以促進成骨及其前體細胞分泌VEGF，VEGF反過來作用于VECs，促進內皮細胞的分裂、增殖、分化及血管形成。兩者相互促進，起到級聯放大的作用，共同促進血管生成。

總之，BMSCs與VEGF 165-HUVEC共移植入大鼠背部缺血皮瓣后，在體內能持續高表達VEGF蛋白，大鼠背部缺血皮瓣的存活率及皮瓣局部的MVD明顯增加，具有提高缺血皮瓣存活的能力。