SAL與EGCG聯合應用對人胃癌細胞株SGC-7901增殖、凋亡的影響及其機制

米志寬，隋麗欣，趙菊梅

(1延安大學醫學院，陜西延安 716000；2延安市腫瘤防治研究重點研究室)

目前，我國胃癌篩查模式不完善，且不同的人群對篩查的認知、態度不一，同時因人口基數大、老齡化趨勢明顯，胃癌發病率及病死率依然很高[1]。鹽霉素(SAL)具有抗腫瘤作用，并靶向作用于腫瘤干細胞，誘導細胞自噬，促進凋亡[2,3]。表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)是綠茶中最主要的活性成分，其具有降低氧自由基、脂質過氧化物及調節致癌物的代謝、抗病毒、廣譜抗菌的特性[4～7]。SAL和EGCG雖然各自有不同的抗腫瘤作用，但目前尚未見兩者聯合作用于胃癌細胞中的相關報道。本研究觀察了SAL聯合EGCG對人胃癌細胞株SGC-7901增殖、凋亡的影響，并探討其可能機制。

1 材料與方法

1.1 胃癌細胞、試劑及儀器 SGC-7901細胞(武漢博士德公司)；RPMI1640培養基、胎牛血清、兔抗人bcl-2、bax抗體、羊抗兔二抗(武漢博士德公司)，EGCG、MTT、AO/EB凋亡試劑盒(美國Sigma公司)，β-actin、bcl-2、bax引物(由上海生工設計合成)；全波長酶標儀(美國Molecular Devices公司)，熒光顯微鏡(日本Nikon E400)，凝膠成像系統GENE(英國Syngene公司)。

1.2 SGC-7901細胞培養 SGC-7901細胞采用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養液培養，置于37 ℃、5%CO2培養箱中。

1.3 SAL、EGCG單獨及聯合干預24、48、72 h后SGC-7901細胞增殖抑制率測算 采用常規胰酶消化，收集對數生長期的SGC-7901細胞，以每孔3×103個細胞接種于96孔培養板中，培養24 h，后分組。聯合組：加入5、10、20、40 mg/L的EGCG及2 μmol/L的SAL；SAL組：加入1、2、4、8 μmol/L的SAL;EGCG組：加入5、10、20、40 mg/L的EGCG；對照組：無藥物，只加培養液。每組均設置5個平行孔，溫育24、48、72 h。每孔加入濃度為5 mg/mL的MTT溶液20 μL，培養4 h。吸凈上清液，每孔加DMSO 150 μL，振蕩10 min，使用酶標儀測定波長為490 nm處的吸光度值(OD值)，對照組調零，各組細胞增殖能力以OD值表示。細胞增殖抑制率=(對照組OD值-實驗組OD值)/對照組OD值×100%，設定聯合組、SAL組、EGCG組為實驗組。以上實驗結果重復3次后取平均值。

1.4 SAL、EGCG單獨及聯合干預48 h后SGC-7901細胞熒光染色情況觀察 采用常規胰酶消化，取對數生長期的SGC-7901細胞，以2×105/mL接種于內有干凈無菌蓋玻片的6孔板中，培養24 h后分組。聯合組：加入2 μmol/L的SAL和10 mg/L的EGCG；SAL組：加入2 μmol/L的SAL；EGCG組：加入10 mg/L的EGCG；對照組：無藥物，僅加培養基。培養48 h后棄培養液，PBS洗滌3次，按照試劑盒說明書進行AO/EB熒光染色，夾出蓋玻片置于載玻片上，熒光顯微鏡觀察拍照。正常細胞生長狀態良好，細胞核形態結構正常，呈綠色熒光；凋亡細胞細胞核固縮，呈紅色熒光；死亡細胞細胞核形態結構正常，呈橘紅色熒光。

1.5 SAL、EGCG單獨及聯合干預48 h后SGC-7901細胞bax、bcl-2 mRNA檢測 采用RT-PCR法檢測。收集聯合組、SAL組、EGCG組、對照組處理48 h的細胞，分組情況與“1.4”相同，按照TRIzol試劑盒說明書操作提取總RNA，取2 μL進行反轉錄。取擴增產物5 μL，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，用凝膠全自動成像系統拍照，以β-actin為內參照，計算bax、bcl-2條帶灰度的比值。

2 結果

2.1 各組不同時點細胞增殖抑制率比較 結果見表1。

表1 各組不同時點細胞增殖抑制率比較

注：與對照組比較，※P<0.05；與同組上一濃度比較，#P<0.05；與同組前一時間點比較，△P<0.05。

2.2 各組細胞熒光染色情況比較 聯合組可見綠色熒光細胞數目減少，紅色熒光凋亡細胞和橘紅色死亡細胞明顯增多；單藥組可見細胞數減少，出現少量細胞核固縮的紅色熒光凋亡細胞和個別細胞核形態結構正常的橘紅色死亡細胞；對照組細胞質豐富，細胞核大小均一，呈綠色熒光(見圖1)。

注：A為對照組;B為SAL組;C為EGCG組;D為聯合組。

圖1SGC-7901細胞核染色結果(AO/EB熒光染色，×200)

2.3 各組細胞bax、bcl-2 mRNA相對表達量比較 結果見表2。

表2 各組細胞bax、bcl-2 mRNA相對表達量比較

注：與對照組比較，※P<0.05。

3 討論

胃癌是嚴重威脅我國人民健康的疾病之一，其較高的復發率仍是治療的難題。胃中分化腺癌的惡性程度比胃低分化腺癌低，但其病情發展較快，因此胃中分化腺癌的治療亦比較困難。早期胃中分化腺癌的治療以手術切除為主，中晚期胃中分化腺癌的治療主張多種方法綜合進行。化療是進展期胃癌的主要治療手段，主要采用細胞毒藥物聯合方案化療。目前，國際上無一致公認的進展期胃癌標準化療方案。因此，改善現有的用藥策略以及尋找更為有效的聯合化療方案是胃癌的重要研究方向。

羧基聚醚類型抗生素SAL不僅對胰腺癌[8]、乳腺癌[9]、白血病[10]等多種腫瘤干細胞有抑制作用，且不易出現耐藥性[11]，能夠增強17-AAG[12]、順鉑[13]、白藜蘆醇[14]等藥物抗腫瘤效應。研究[15]證實，SAL具有抗癌作用，其作用機制的主要信號通路如下：①抑制Wnt/β-catenin信號通路相關靶基因表達；②增加Akt/PKB通路活性；③抑制mTOR信號通路轉導；④使細胞內活性氧累積。EGCG抗腫瘤作用與促進自噬、生長抑制、周期停滯、誘導凋亡、抗血管生成、抑制侵襲等有關[16]。研究[17]發現，SAL能減少阿霉素、順鉑、氟尿嘧啶、吉西他濱、吉非替尼、長春新堿等藥物的耐藥性。綠茶中的EGCG具有廣泛的積極生物活性，在心血管、癌癥、神經退行性疾病、代謝綜合征和2型糖尿病等嚴重慢性疾病中均可發揮保護作用[18]。在抗癌方面，EGCG對非小細胞肺癌[19]、黑色素瘤[20]、胰腺癌[21]等惡性腫瘤中具有一定促凋亡、抑增殖效果。長期單一使用化療藥易使腫瘤細胞對化學治療藥物敏感性降低，幾種藥物的聯合應用可以克服腫瘤細胞對某一類藥物的耐藥。本研究顯示，SAL、EGCG單藥隨著藥物濃度的增加和作用時間的延長，均能呈劑量時間依賴性抑制SGC-7901細胞增殖，聯合用藥時抑制細胞增殖效果更顯著，聯合用藥時EGCG能減少SAL的用量，增強SGC-7901細胞對SAL敏感度；從熒光染色結果可見，對照組均為均勻綠色熒光、形態正常的細胞，在EGCG或SAL處理48 h后，SGC-7901細胞形態有改變，并出現少量紅色熒光凋亡細胞，在EGCG和SAL聯合48h后發現SGC-7901細胞減少，紅色熒光凋亡細胞比例更明顯，提示SAL、EGCG均能抑制SGC-7901細胞增殖，并誘導凋亡，兩者聯合效果更佳。

凋亡通過對一系列相關基因的激活、表達以及調控等作用，如bcl-2家族、caspase家族、癌基因、抑癌基因等，為更好地適應生存環境，而在機體中散在的、逐個地從死亡和消失的一種細胞程序性死亡。bcl-2、bax是bcl-2家族中重要的凋亡調節因子。bcl-2抑制細胞凋亡與凋亡促進基因bax相拮抗，共同決定細胞的凋亡[22]。Gao等[23]學者發現，SAL能通過上調凋亡基因bax、細胞色素C、凋亡肽酶激活因子1表達，下調bcl-2表達來調控凋亡。本研究顯示，聯合用藥可使SGC-7901細胞中bax表達升高，bcl-2表達下降，聯合用藥使兩種蛋白變化更明顯，提示SAL和EGCG聯合用藥可增強SGC-7901細胞凋亡的敏感性，其發生機制可能與下調bcl-2蛋白表達、上調bax蛋白表達有關。

總之，SAL、EGCG均能抑制SGC-7901細胞增殖，并誘導凋亡，兩者聯合效果更佳，其機制可能與降低bax表達及升高bcl-2表達有關。SAL與EGCG的聯合應用可增強藥物的敏感性，可能是治療胃癌的一種有效的途徑。