RSPO2過表達人肝星狀細胞株LX-2中差異表達蛋白的篩選及生物學功能分析

殷新光，薛文英，徐英，吳一鳴，袁芳，鄒丹丹

(1嘉興學院附屬婦女兒童醫院，浙江嘉興 314000；2嘉興學院附屬第一醫院；3杭州佰辰醫學檢驗所有限公司)

RSPO蛋白家族由4個同源蛋白組成，共享60%的序列同源性且結構域相似，廣泛參與生物體的生長發育及各項生命活動[1]。已知RSPO可通過刺激富含亮氨酸重復序列的G蛋白偶聯受體(LGR)4、LGR5、LGR6來增強Wnt信號傳導[2]，Wnt信號傳導與肝纖維化及眾多癌癥密切相關[3,4]。此外，CCl4誘導的肝纖維化小鼠中RSPO2表達顯著高于正常小鼠；同時RSPO2在人類纖維化肝組織中過表達，而在正常肝組織中多檢測不到[1]，但是關于RSPO2在肝纖維化發病過程中所起作用尚不明確。肝星狀細胞作為肝臟非實質細胞之一，其激活和增生是肝纖維化發生、進展的中心環節[5]。隨著對肝纖維化研究的不斷深入，以肝星狀細胞為切入點探索肝纖維化治療的新方法逐漸引起人們的興趣。本研究在前期研究RSPO2過表達會影響肝纖維化的基礎上[1]，以人肝星狀細胞作為研究對象，通過蛋白組學手段分析RSPO2過表達肝星狀細胞LX-2與正常LX-2細胞間的差異表達蛋白，篩選出差異表達蛋白，為進一步研究肝纖維化發病機理、過程，以及RSPO2蛋白在肝纖維化過程中所起的作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 細胞及主要試劑、儀器 LX-2細胞購自上海紀寧實業有限公司；293T cDNA、pcDNA3.1(-)購自上?？殿伾锟萍加邢薰?，RPM1640培養基和胎牛血清、胰蛋白酶購自Sigma-Aldrich公司，高保真聚合酶、T4 DNA 連接酶購自Toyobo公司，膠回收試劑盒購自Axygen公司；PCR儀、凝膠成像分析儀購自Bio-Rad公司；Q-Exactive質譜儀、液相色譜儀Easy nLC 1000購自Thermo公司，RNeasy Mini kit購于Qiangen公司。

1.2 RSPO2過表達載體構建 氨基酸序列為1-243的全長-人源RSPO2基因(GeneID：340419，NM_178565.4)以293T細胞的cDNA為模板經PCR純化所得，其PCR引物設計在5′和3′末端分別引入限制性內切酶BamHⅠ和HindⅢ的酶切位點。正向和反向引物序列如下：CCACACTGGACTAGTGGATCCATGCAGTTTCG-CCTTTTCTC和CAGCGGTTTAAACTTAAGCTTTTATTGGTTGCTCTGTCTG。純化后的PCR產物經凝膠電泳圖判定符合預期的核酸片斷大小，并將它與具有相同酶切的質粒pcDNA3.1(-)連接成功后轉入Top10感受態，重組質粒測序驗證正確。

1.3 LX-2細胞復蘇傳代及RSPO2過表達載體轉染、鑒定 LX-2細胞置于完全培養基(含10%FBS和雙抗的RPMI1640培養基)，37 ℃，5%CO2條件下進行培養。復蘇后的細胞依據其生長狀態進行傳代，一般匯合程度約達90%。取細胞以5×105接種于6孔板中，加入無雙抗的完全培養基，當細胞生長到70%～80%匯合時轉染。具體轉染步驟：100 μL無血清的RPMI1640培養基中分別加入重組質粒1 200 ng，Attractene Transfection Reagent轉染試劑4.5 μL，輕輕混勻。室溫孵育10 min后，用含雙抗的完全培養液換液，37 ℃、5%CO2培養箱中繼續培養。過表達判定：培養板接種細胞之前先用標記筆在6孔板背面畫橫線標記。將轉染RSPO2重組質粒的LX-2設為實驗組，消化后接入6孔板，細胞鋪滿板底，用1 mL槍頭垂直于孔板制造細胞劃痕，盡量保證各個劃痕寬度一致。吸去細胞培養液，用PBS沖洗孔板3次，洗去劃痕產生的細胞碎片，加入無血清RPMI1640培養基，0、12 h取出拍照，并根據收集圖片數據分析實驗結果。對照組細胞遷移距離為(38.8±4.3)μm，實驗組為(69.0±6.1)μm，兩組比較，P<0.05，說明LX-2細胞中成功地過表達了RSPO2基因。再利用RNeasy Mini kit抽提實驗組和對照組總RNA，以管家基因β-actin作為內參，對細胞總RNA進行均一化處理，利用循環閾值(Ct值)的變化計算RSPO2基因的相對表達量。對照組RSPO2 mRNA表達水平為2.050 96E-05±8.629 88E-07，實驗組為0.015 279±0.000 472，兩組比較，P<0.05。

1.4 RSPO2過表達的肝星狀細胞LX-2和正常LX-2細胞差異表達蛋白篩選 將實驗組與對照細胞放入37 ℃、5%CO2培養箱中培養，48 h后收集兩組細胞，PBS洗3次，通過溶液內酶解的方式制備細胞全蛋白樣本[6]，使用LC-MS/MS對細胞酶解液進行蛋白組學分析。質譜數據采集采用數據依賴模式(DDA)，選取強度最高的10個母離子通過HCD碰撞打碎(NCE：30%)，分別獲得二組譜圖。質譜采集參數為：正離子模式；毛細管電壓：2.1 kV；一級質量范圍Mass Range：300～1 500，分辨率70000 @m/z 200；二級分辨率17 500 @ m/z 200；啟用AGC，target value 2E5；母離子選擇質量窗口1.6 m/z。原始文件(raw)用Max Quant 1.5.2.8分析數據[7]，并用Maxquant自帶算法鑒定多肽及蛋白質，并給出相對定量信息[8]。搜庫參數：可變修飾Variable modification： Oxidation(M)，Acetyl(Protein N-term)；固定修飾：Fixed modifications： Carbamidomethyl(C)。搜索使用的數據庫為uniprot.human.fasta(201607)，protein sequence items：92607。結果過濾參數：peptide FDR≤0.05；protein FDR≤0.05。

1.5 差異表達蛋白的生物信息學分析 對上述質譜結果進行進一步分析，首先刪除缺失值超過60%的蛋白，再利用R語言的KNN算法對數據中的缺失值進行補充，以組間表達差異>1.2(上調)或<0.8(下調), 且P<0.05(student′st-test)為顯著差異標準篩選差異表達蛋白。利用生物信息學在線數據庫DAVID 6.8對篩選出的差異表達蛋白質進行功能注釋分析(GO)，得到RSPO2過表達人肝星狀細胞和正常人肝星狀細胞分別在生物過程、細胞成分和分子功能上富集的GO Term。

2 結果

2.1 RSPO2過表達LX-2細胞和正常LX-2細胞的蛋白表達質譜 對RSPO2過表達LX-2細胞與正常LX-2細胞分別進行3次LC-MS分析，得到6個raw data數據，共鑒定到2 423種蛋白。大多數被鑒定到的蛋白所含肽段數<10種，且蛋白數量隨著匹配的肽段數的增加主要呈現逐漸減少的趨勢。

2.2 RSPO2過表達LX-2細胞與正常LX-2細胞的差異表達蛋白 通過差異表達分析共獲得233個差異表達蛋白。與正常LX-2細胞比較，RSPO2過表達LX-2細胞中表達下調的蛋白有115個，表達上調的蛋白有118個(P<0.05)，詳見表1，表1中只列出了差異較為顯著的15個高表達蛋白和15個低表達的蛋白，其中SEC62[9]、PCMT1[10]、S100A11等基因已被報道與肝癌密切相關，其他蛋白因差異不明顯且報道文章較少，故表中未列出。

2.3 RSPO2過表達LX-2細胞差異表達蛋白的功能 利用David軟件對115個低表達蛋白和118個高表達蛋白進行GO注釋分析。這些生物學過程主要包括核轉錄mRNA分解代謝過程，無義介導衰變(校正P值7.62E-07)，翻譯起始(校正P值1.71E-06)，翻譯(校正P值7.27E-06)，RNA剪接(校正P值8.50E-06)，mRNA加工(校正P值7.59E-05)等，這些富集到的過程大多與RNA的轉錄與翻譯過程有關，主要分泌到細胞外，位于細胞膜、細胞質、溶酶體等位置，主要參與poly(A)RNA結合、RNA結合、核苷酸結合、核糖體結構成分等過程。

3 討論

肝星狀細胞作為肝臟非實質細胞之一，其持續激活是肝纖維化發生發展過程中的關鍵環節。激活的肝星狀細胞一方面通過增生和分泌細胞外基質參與肝纖維化的形成和肝內結構的重建，另一方面通過細胞收縮使肝竇內壓升高，這兩類變化最終奠定了肝纖維化、門靜脈高壓癥發病的病理學基礎。隨著對肝纖維化研究的不斷深入，以肝星狀細胞為切入點探索肝纖維化治療的新方法逐漸引起人們的興趣。

表1 RDPO2高表達人肝星狀細胞LX-2中差異表達蛋白

注：0.00*表示該蛋白在RSPO2過表達星狀細胞中不表達而在對照組中表達；∞*表示該蛋白在RSPO2過表達星狀細胞中表達而在對照組中不表達。

RSPOs蛋白家族均為分泌性蛋白，可通過激活并協同Wnt/β-catenin信號通路參與對細胞增殖和分化的調控，在腸癌、食管癌等多種疾病的發生發展過程中起到不可忽視的作用[11]。研究[12,13]發現，在人纖維化肝組織、肝纖維化小鼠模型中、特定的肝癌細胞系中均觀察到R-Spondin2的過表達。

本研究選擇人肝星狀細胞構建RSPO2過表達細胞系，通過劃痕實驗確定RSPO2過表達的LX-2細胞12 h內遷移率明顯大于對照組，表明在LX-2細胞中成功地過表達了RSPO2蛋白。隨后，研究RSPO2過表達LX-2細胞與正常LX-2細胞蛋白組學譜，獲得候選差異表達蛋白質共計233個，其中115個蛋白質在RSPO2過表達細胞中表達下調，118個表達上調，這些差異表達蛋白參與了很多與細胞轉錄、復制、增殖相關的信號通路。

在表達上調的蛋白中，S100鈣結合蛋白A11(S100A11)是S100蛋白家族中的一員，與鈣結合后蛋白構象發生改變再與靶蛋白結合，其主要功能是轉導鈣依賴性的細胞調節信號，參與細胞增殖、分化、凋亡、炎癥發生等多種生命過程。研究[14]表明，在人角蛋白細胞內，S100A11與腫瘤密切相關TGF-β/Smads通路有關。當胞外鈣離子和TGF-β濃度上升時，S100A11被PKCa磷酸化并轉移至細胞核，聯合TGF-β信號轉導分子Smads，通過激活Sp1/Sp3誘導p21/WAF1抑制DNA合成，以表現出生長抑制作用[15]。Smad-S100A11介導的通路可轉導高濃度TGF-β觸發的生長抑制信號，即抑制S100A11蛋白活性可達到抑制TGF-β傳導的細胞生長的信號。這一研究在人肝癌、人宮頸癌細胞中已被證實。

PCMT1也被稱為PIMT，是一種修復酶，能促使自發形成的異構化的天冬氨酸殘基轉化成正常構型。Dong等[16]發現，PCMT1蛋白表達與臨床分期，肌層浸潤，淋巴結轉移和遠處轉移明顯相關，生存分析顯示，PCMT1蛋白高表達是膀胱癌患者獨立的不利預后因素。體外實驗表明，PCMT1通過調節上皮-間質轉化(EMT)相關基因表達調控膀胱癌細胞的遷移和侵襲，但對增殖沒有影響。

異源三聚體Sec61復合物和二聚體Sec62/Sec63復合物位于人內質網膜中，在新合成的前體肽易位到內質網中起到重要的作用，此外，SEC基因的突變、擴增和過表達與各種疾病相關，包括腎臟和肝臟疾病，糖尿病和癌癥。多篇研究表明了SEC62作為頭頸癌、前列腺癌和肺癌的預后和預測生物標志物的相關性[9,17]。

在表達下調的蛋白中，TET2蛋白是一種漸進保守的加雙氧酶，屬于TET家族3個成員之一，在去甲基化過程中將5-甲基胞嘧啶氧化為5-羥甲基胞嘧啶，從而在表觀遺傳水平上調控基因的表達[18]。研究發現，TET2在骨髓增殖性腫瘤[19]和骨髓增生異常綜合征[20]患者中存在突變，在骨髓增生異常綜合征中的突變率高達25%～30%。TET2的突變包括基因的缺失、插入、移碼突變等，并伴隨5-羥甲基胞嘧啶的總量的顯著減少[21]。

AIMPs家族有AIMP1、AIMP2、AIMP3三個亞型蛋。AIMP2也被稱為p38/JTV-1蛋白,是AIMPs家族三個亞型之一，參與了多種生物學功能，如細胞分化和凋亡等[22]。AIMP2是一種潛在的腫瘤抑制因子，AIMP2的剪接突變體AIMP2-DX2(缺少外顯子Exon2)與AIMP2競爭性結合目標蛋白，抑制了AIMP2的抗腫瘤活性，表現為促癌因子。抑制AIMP2-DX2可明顯抑制腫瘤細胞這一現象表明了AIMP2-DX2有可能成為潛在的癌癥新靶點。因此，AIMP2-DX2也成為目前研究的熱點[22～24]。Yum等[25]在小鼠模型中研究了腸內穩態和腫瘤發生的AIMP2和Wnt/β-catenin信號傳導之間的關系，并發現AIMP2能結合到Wnt/β-catenin信號通路重要的組成成分DVL上，從而抑制了DVL與AXIN的相互作用，此外AIMP2是通過以Aimp2基因劑量依賴性方式抑制Wnt/β-連環蛋白信號傳導來抑制腸類器官的形成和生長，低表達的AIMP2可能降低了對Wnt/β-連環蛋白信號的抑制作用，從而導致細胞的代謝異常。與正常LX-2組比較，過表達RSPO2的LX-2蛋白組AIMP2表達顯著降低。

總之，通過蛋白組學方法篩選出與肝臟相關疾病的差異表達蛋白，可能作為潛在的生物學靶點，并為RSPO2介導的肝纖維化過程的研究提供了更多的研究資料。目前的工作還需后續相關工作進一步鑒定和驗證。