基于基因組突變數據分析肝癌預后分子標志物

茅新如 劉文斌 曹廣文

原發性肝癌是男性第二大癌癥死亡原因［1]。我國原發性肝癌中95%是肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）。早期HCC患者術后易復發轉移，1年復發率超過50%，5年生存率僅為20%～30%，而晚期HCC缺乏有效的治療手段［2]。因此，尋找預測HCC復發和死亡風險的分子標志物尤為重要。

腫瘤突變負荷（tumor mutation burden，TMB）被定義為每百萬堿基中被檢測出的體細胞基因編碼錯誤、堿基替換、基因插入或缺失錯誤的總數。研究表明，TMB是免疫檢查點抑制劑敏感的標志物［3-5]。一項研究［6]分析了TCGA中22種腫瘤共7 882例患者，發現在膀胱癌、胃腺癌、子宮內膜癌中，TMB與患者預后呈正相關，但在頭頸鱗癌、腎透明細胞癌中，TMB則與患者預后呈負相關。此外，DEVARAKONDA等［7]在908例可切除的肺癌患者中發現高TMB的患者預后較好。然而，TMB對HCC的預后價值尚無系統性報道。

近年來，在驅動肝癌發生發展的分子機制研究有了較大進展，發現多種基因與腫瘤的發生發展有關［8-11]。常見驅動HCC發生發展信號通路包括細胞周期調控通路、WNT-β-catenin通路、表觀遺傳和染色質重塑通路、AKT-mTOR-MAPK通路及氧化應激通路等［12]。研究表明，上述信號通路的某個基因突變均可影響患者預后。AMADDEO等［13]發現HBV相關的HCC患者中，TP53 R249S突變與PFS有關。ZHAN等［14]通過Meta分析發現TP53突變的HCC患者總生存期（overall survival，OS）和無復發生存期（disease free survival，DFS）較差。WANG 等［15]研究報道β-catenin突變的HCC患者預后優于無突變者。AHN等［16]在231例可手術的HCC患者研究中發現RB1突變和缺失與患者復發有關。本研究通過對TCGA和ICGC等數據庫中HCC全基因組和全外顯子的二代測序結果進行分析，探討TMB、關鍵信號通路的基因變異與HCC預后的關系。

1 資料與方法

1.1 數據來源

從癌癥基因組圖譜（the cancer genome atlas，TCGA）數據庫中獲取376例HCC患者的全外顯子測序數據，從國際癌癥基因組聯（international cancer genome consortium，ICGC）（https：//dcc.icgc.org/）數據庫中分別獲取JP隊列394例及FR隊列250例HCC患者的全基因組測序數據，從cBioPortal數據庫（http：//www.cbioportal.org/）獲取 schulze2015隊列 243例HCC患者的全外顯子測序數據［17]，同時下載患者的臨床資料。檢索條件如下：⑴case選項，primary site：Liver；其他選項默認系統設置。⑵Files選項，data type：mutation，copy number alterations（or copy number somatic mutations），clinical。

1.2 方法

采用R軟件對篩選獲取的年齡、性別、臨床分期、肝硬化、HBV感染、血管浸潤程度、分化程度、疾病復發時間和總生存時間等數據進行處理。TMB定義為編碼區域內非沉默體細胞突變的總數［18]。將TMB數值從大到小排列，前四分位定義為高TMB，將各樣本數據分為高TMB組和低TMB組。LLOVET等［12]列出影響HCC發展的主要信號通路，包括細胞周期調控通路、WNT-β-catenin通路、表觀遺傳和染色質重塑通路、AKT-mTOR-MAPK通路及氧化應激通路（表1）。將一種信號通路基因列表中的任何一個基因發生變異定義為變異，將樣本數據分為基因變異組和無基因變異組。

表1 HCC 5大關鍵通路包含的基因和變異類型Tab.1 The major genes and alterations contained in the five key pathways in HCC patients in this study

1.3 評價指標

本研究預后評價指標包括OS和DFS。OS定義為確診之日起至因任何原因引起死亡的時間。DFS定義為從初次治療至最早出現局部復發、遠處轉移或死亡的時間。

1.4 統計學方法

采用R 3.3.1和Stata 15進行數據分析。采用Pearson相關分析分析TMB與患者臨床病理特征的關系，TCGA、schulze2015和FR隊列中TMB呈偏態分布，因此對TMB進行對數轉換后，分析其與年齡、腫瘤大小等的相關性。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，Log-rank檢驗TMB和5大關鍵信號通路的基因變異與DFS、OS的關系，同時采用Cox回歸計算風險比（HR）及其95%可信區間（CI）。以雙側P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 納入隊列的基本情況

本研究共納入4個隊列。TCGA隊列376例，其中男性占 67.55%，年齡（59.45±13.51）歲，亞洲人占42.55%，白種人占49.73%。JP隊列394例，其中男性占 75.89%，年齡（64.89±10.59）歲，均為亞洲人。FR 隊列250例，其中男性占 78.80%，年齡（63.20±12.40）歲，均為白種人。schulze2015隊列243例，男性占80.25%，平均年齡（63.32±11.62）歲，均為白種人。見表2。

2.2 TMB與HCC患者臨床病理特征的相關性

在4個隊列中均發現，對數轉換后的TMB與年齡呈正相關（TCGA：r=0.224，P＜0.001；schulze2015：r=0.260，P＜0.001；JP：r=0.122，P=0.015；FR：r=0.217，P＜0.001）；男性 TMB 高于女性（PTCGA=0.038，PJP=0.00，PFR=0.039，Pschulze2015=0.068）。在 schulze2015 隊列中，對數轉換后的TMB與腫瘤大小呈正相關（r=0.204，P=0.002），但未發現TMB與BCLC分期有關（P＞0.05），有血管浸潤的HCC患者TMB較高（P＜0.001）；分化級別Ⅰ～Ⅱ級的患者TMB較Ⅲ～Ⅳ級患者高（P=0.012）。

2.3 5大關鍵信號通路基因變異情況

比較5大關鍵信號通路不同種族的基因變異情況，發現TCGA隊列中亞洲人群的細胞周期調控通路的基因變異頻率為53.13%，高于TCGA隊列的白種人群（35.29%）、FR隊列人群（36.40%）及JP隊列人群（35.79%）。TCGA隊列中亞洲人群RB1基因、TP53基因、CDKN2A基因及CCND1基因在細胞周期調控通路中的變異頻率均高于隊列中的白種人群和FR 隊列人群（RB1：11.88%vs 10.16%，3.06%；TP53：33.75%vs 22.99%，23.60%；CDKN2A：12.05%vs 3.74%，5.06%；CCND1：8.13%vs 5.35%，4.40%）。其他通路基因變異情況見表3。

2.4 TMB與HCC患者預后的關系

TCGA隊列中，與低TMB組比較，高TMB組HCC患者的OS明顯降低（70.0個月vs 27.5個月，P＜0.001）；高TMB組的DFS亦明顯降低，但差異無統計學意義（21.6個月vs 18.4個月，P=0.088）。調整性別、年齡、HBV感染、肝硬化、AJCC分期、ECOG評分等混雜因素后，高TMB組HCC患者的死亡風險是低TMB組的2.156 倍（HR=2.156，95%CI：1.471～3.159，P＜0.001），但未發現TMB與DFS差異有統計學意義（HR=1.322，95%CI：0.933～1.873，P=0.117）。在 JP 隊列和 FR 隊列中，均未發現TMB與OS、DFS差異有統計學意義。見圖 1、表 4、表 5。

2.5 關鍵信號通路基因變異與HCC患者預后的關系

在TCGA隊列、JP隊列和FR隊列中，發現細胞周期調控通路基因變異的HCC患者中位DFS（TGCA：13.1個月vs 29.3個月，P=0.001；JP：17.2個月 vs 39.2個月，P=0.009；FR：9.3個月 vs 25.8個月，P＜0.001）和中位 OS（TGCA：46.8 個月 vs 69.5 個月，P=0.009；JP：80.3 個月 vs 120.0 個月，P=0.062；FR：28.9個月vs 60.0個月，P＜0.001）均低于無變異的患者，見圖2。調整相關混雜因素后，多因素Cox回歸分析顯示，細胞周期調控通路基因變異的HCC患者復發風險（HRTCGA=1.707，95%CI：1.260～2.314，P=0.001；HRJP=1.603，95%CI：1.143～2.248，P=0.006；HRFR=2.453，95%CI：1.593～3.777，P＜0.001）和死亡風險（HRTCGA=1.536，95%CI：1.075～2.193，P=0.018；HRJP=1.740，95%CI：1.079～2.809，P=0.023；HRFR=2.479，95%CI：1.544～3.980，P＜0.001）均高于無變異者。其余關鍵信號通路基因變異與HCC患者預后的關系見表6、表7。

表2 TCGA、JP、FR和schulze2015 4個隊列患者的一般資料Tab.2 Patients characteristics of TCGA，JP，FR and schulze2015

表3 不同種族中5個關鍵信號通路的突變頻率Tab.3 Mutation frequency in five key signal pathways in different races

表4 TMB與HCC患者DFS的關系Tab.4 Relationship between TMB and DFS in HCC patients

表5 TMB與HCC患者OS的關系Tab.5 Relationship between TMB and OS in HCC patients

表6 關鍵信號通路的基因變異與HCC患者DFS的關系Tab.6 Relationship between key signal pathway and DFS in HCC patients

表7 關鍵信號通路的基因變異與HCC患者OS的關系Tab.7 Relationship between key signal pathways and OS in HCC patients

圖1 TMB與HCC患者DFS和OS的關系Fig.1 Relationship of TMB and DFS and OS in in HCC patients

圖2 細胞周期調控通路的基因變異與HCC患者DFS和OS的關系Fig.2 Relationship of genetic aberrations in cell cycle control pathway genes and DFS and OS in HCC patients

3 討論

在慢性炎癥促進癌癥發生發展過程中，體細胞突變和修復功能失調，絕大部分變異細胞失去生存優勢，逐漸被淘汰，賦予細胞生長優勢的變異得以保留下來，體現了“癌癥進化發育學”的基本特征［8]。本研究發現在HCC中TMB隨年齡增長而增加，可能與細胞增殖歲月痕跡有關。CHALMERS等［19]在10萬例不同癌種患者的研究中亦發現，隨著年齡的增加TMB顯著增加（P＜1×10-16），線性模型預測10歲和90歲之間TMB的差異為2.4倍。男性高發是肝癌的一個重要流行病學特征，但亦有研究［19]發現男性與女性患者TMB無顯著差異。本研究發現男性TMB顯著高于女性，可能與男性患者中有更多體細胞突變積累有關。ZHANG等［20]從599例中國臨床樣本中發現早期肺腺癌患者的TMB水平低于晚期肺腺癌，但該研究未發現TMB與臨床分期有關，因此需要更多的臨床研究驗證。2018年ESMO報道，TMB在不同腫瘤中的預后預測價值不同，且TMB在同一癌種不同分期階段的預后預測價值也不盡相同［6]。這可能與TMB在不同腫瘤和腫瘤的不同階段發揮著不同的作用有關。本研究同時發現，TCGA隊列中高TMB的HCC患者預后不良，但該結論未能在FR隊列及JP隊列中得到驗證，可能是不同隊列校正的混雜因素不相同造成。

細胞周期調控通路的基因是HCC發展過程中的關鍵基因，驅動腫瘤的發展。有研究表明，TP53、RB1等分子變化與預后不良有關，可能導致更具攻擊性的表型［13-14，16]。本研究分析5大關鍵信號通路的基因變異與HCC復發和死亡的關系，均未發現WNT-β-catenin通路、表觀遺傳與染色質重塑通路、氧化應激信號通路的基因變異影響HCC患者的DFS和OS。其中AKT-mTOR-MAPK信號通路基因變異的患者DFS和OS更短，但該結論只在TCGA和JP隊列中成立。進一步納入TP53、RB1、CCND1和CDKN2A 4個細胞周期調控通路高頻突變基因進行分析，發現其細胞周期調控通路的基因變異在TCGA隊列中頻率為53.13%，JP隊列為35.79%，FR隊列為36.40%，且攜帶此細胞周期調控基因變異的HCC患者更早出現疾病復發和死亡，上述結果校正了混雜因素且在TCGA隊列、FR隊列及JP隊列中均得到了驗證，說明這4個基因突變與HCC患者的預后有關，細胞周期調控通路可能對HCC預后有一定預測作用。

本研究發現年齡大、男性或腫瘤直徑大的HCC患者TMB更高，細胞周期通路的基因變異顯著促進HCC早期復發和死亡。但由于納入隊列提供的信息有限，無法校正其他因素對DFS和OS的影響，因此相關結論仍有待進一步驗證。