Hsa-miR-4282對肝癌細胞系SMMC-7721生長的影響

王匯鋒 陳潔 羅濤 陳苗 趙媛 王奪 黎樂群

原發性肝癌是全球第6大惡性腫瘤，也是癌癥死亡的常見原因［1]，其中我國新發病例數占全部發展中國家總發病例數的50%以上［2]。原發性肝癌（以下簡稱肝癌）可分為肝細胞癌、膽管細胞癌和混合細胞癌3種，其中大多為肝細胞癌。目前研究已證實其發生發展與乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、肝硬化、黃曲霉素甚至情緒等多種疾病及因素相關［3-6]，但肝癌的病因及確切分子機制尚未完全清楚。miRNA是一類由內源基因編碼的長度約為20個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，可通過與一個或多個靶基因mRNA的3'-非翻譯區結合而抑制靶基因表達，從而影響腫瘤的生物學行為。多項研究［7-9]證明miRNA參與多種腫瘤細胞分化、周期、凋亡、增殖、侵襲、轉移等生物學行為。但目前尚無關于Hsa-miR-4282與肝癌的相關文獻報道，本研究探討Hsa-miR-4282對肝癌細胞生長的影響及其作用機制，以期為闡明肝癌的發病機制提供依據。

1 材料和方法

1.1 主要材料與試劑

人正常肝上皮細胞系HL-7702及人肝癌細胞系MHCC97-H、SMMC-7721均購自上海生命科學院細胞庫，保存于本實驗室。胎牛血清、DMEM購自美國Gibco公司，AnnexinⅤ：FITC Apoptosis Detection KitⅠ試劑盒購自美國BD公司。LipofectamineTM6000購自上海碧云天公司。Trizol試劑購自美國Invitrogen公司。miRcute Plus miRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit和miRcute Plus miRNA qPCR Detection Kit試劑盒購自北京天根公司。microRNA-4282mimics、microRNA-4282 inhibitor、microRNA-4282 mimics negative control、microRNA-4282 inhibitor negative control均購自廣州銳博生物科技有限公司。所有引物合成均由北京天根公司設計及完成。

1.2 組織標本

20例肝癌組織及其相應癌旁組織標本均來自廣西醫科大學附屬腫瘤醫院肝膽外科2014—2016年的手術患者，術后病理檢查確診為原發性肝癌。本研究通過醫院倫理委員會的批準，患者知情同意。

1.3 細胞培養及轉染

肝癌SMMC-7721、MHCC97-H細胞和人正常肝上皮細胞HL-7702均用含10%胎牛血清及1%青鏈霉素的DMEM完全培養基（以下簡稱完全培養基），置于37℃、5%CO2培養箱中培養，每1～3 d用EDTA-胰蛋白酶消化液消化、傳代。

細胞轉染前24 h，胰蛋白酶消化對數生長期的肝癌SMMC-7721細胞，用完全培養基調整細胞數為4×105個/孔，接種于 6 孔板中，置于 37 ℃、5%CO2培養箱中常規培養。轉染前，棄除6孔板中的培養基，PBS緩沖液清洗3次后備用。采用瞬時轉染法分別將Hsa-miR-4282 mimics（上調組）和 Hsa-miR-4282 inhibitor（下調組）轉染肝癌SMMC-7721細胞，上調組和下調組分別設置相應陰性對照組。按說明書推薦量 mimics為 50 nmol/L、inhibitor為 100 nmol/L，分別加入1.5 mL離心管中，并加入120 μL Opti-MEM，混勻后室溫靜置孵育5 min；再加入5 μL LipofectamineTM6000，孵育20 min，6 h后完全培養基補足至2 mL/孔，24 h后更換完全培養基。轉染后通過qRT-PCR驗證轉染效率。

1.4 MTT實驗檢測細胞增殖能力

取轉染48 h后的4組細胞，用完全培養基調整細胞量，以3 000個/100 μL的細胞懸液接種于96孔板中央（5復孔/組），分別于 24 h、48 h、72 h、96 h取1 塊96孔板，棄原培養基后加入5 mg/mL MTT工作液100 μL/孔，常規培養 4 h后棄上清液，加入DMSO 150 μL/孔，搖床上搖勻10 min后在酶標儀上在570 nm處測吸光度（OD）值。以上實驗重復3次。

1.5 平板克隆形成實驗檢測細胞克隆形成能力

取轉染48 h后計數的4組細胞，充分吹勻至單個懸浮細胞，以500個/孔接種至預先加入5 mL完全培養基的6孔板（3復孔/組）中混勻，于培養箱中培養2～3周。當孔板中出現肉眼可見的克隆時終止培養，棄培養基，用PBS浸洗3次，甲醇固定30 min，0.1%結晶紫染色1 h，風干后拍照。以上實驗重復3次。

1.6 實時熒光定量PCR檢測Hsa-miR-4282的表達

采用天根公司miRcute Plus miRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit逆轉錄試劑盒合成cDNA。反應條件：42℃ 60 min；95℃5 min。按試劑盒說明書建立反應體系，以U6為內參進行相對定量分析。實時熒光定量PCR采用ABI公司Stepone Plus系統進行分析，反應條件：95 ℃ 15 min；94 ℃ 20 s，65 ℃ 30 s，72 ℃34 s，5個循環；94 ℃ 20 s，60 ℃ 34 s，45個循環。采用2-△△Ct法分析各個樣品的相對表達量。以上實驗重復3次。

1.7 流式細胞術檢測細胞凋亡情況

取計數后的肝癌SMMC-7721細胞，以4×105個/孔接種于6孔板中，24 h后轉染Hsa-miR-4282模擬物和抑制物。轉染48 h后收集孔內細胞，按照BD公司AnnexinⅤFITC Apoptosis Detection KitⅠ試劑盒說明書操作，1 h內上機檢測細胞凋亡。以上實驗重復3次。

1.8 統計學方法

采用SPSS 22.0軟件進行統計分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，多組比較采用LSD-t檢驗；兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。以雙側P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Hsa-miR-4282在不同肝細胞株及組織標本中的表達

實時熒光定量PCR檢測結果顯示，Hsa-miR-4282在肝癌MHCC97-H細胞和肝癌SMMC-7721細胞中的相對表達量分別為0.523±0.048和0.411±0.069，以人正常肝上皮細胞HL-7702為對照，Hsa-miR-4282在肝癌MHCC97-H 細胞（t=14.146，P=0.005）和 SMMC-7721 細胞（t=12.153，P＜0.001）中的相對表達量均降低。HsamiR-4282在肝癌組織中的相對表達量為0.68±0.35，亦低于癌旁組織（t=3.987，P=0.001），見圖 1。

2.2 Hsa-miR-4282轉染肝癌SMMC-7721細胞

轉染Hsa-miR-4282 mimics及inhibitor 48 h后，上調組Hsa-miR-4282的相對表達量為28.326±2.301，其表達水平高于相應陰性對照組（t=16.196，P=0.004）；下調組的相對表達量為0.287±0.037，其表達水平低于相應陰性對照組（t=27.320，P=0.001），見圖 2。

圖1 Hsa-miR-4282在不同肝細胞及組織中的表達Fig.1 Expression of Hsa-miR-4282 in different liver cells and tissues

圖2 轉染后肝癌SMMC-7721細胞中Hsa-miR-4282的表達Fig.2 Expression of Hsa-miR-4282 in liver cancer SMMC-7721 cells after transfection

2.3 Hsa-miR-4282對肝癌SMMC-7721細胞增殖能力的影響

MTT實驗結果顯示，轉染24 h、48 h、72 h及96 h后，上調組肝癌SMMC-7721細胞OD值均低于其陰性對照組，而下調組OD值高于其陰性對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05），見表 1、圖 3。

7721 cells after transfection

表1 MTT法檢測轉染后肝癌SMMC-7721細胞的增殖情況Tab.1 MTT assay for detection of cell proliferation after upregulation and down-regulation of miR-4282

2.4 Hsa-miR-4282對肝癌SMMC-7721細胞克隆形成能力的影響

平板克隆實驗結果顯示，下調組肝癌SMMC-7721細胞克隆數高于下調陰性對照組［（240±7）個 vs（191±10）個，t=5.650，P=0.005）] ，而上調組細胞克隆數低于上調陰性對照組［（146±10）個 vs（193±12）個；t=4.310，P=0.013] ，見圖 4。

圖4 平板克隆形成檢測轉染后肝癌SMMC-7721細胞的克隆形成能力Fig.4 Plate colony formation assay for clonal formation ability of liver cancer SMMC-7721 cells after transfection

2.5 Hsa-miR-4282對肝癌SMMC-7721細胞凋亡的影響

流式細胞儀檢測結果顯示，上調組肝癌SMMC-7721細胞凋亡率高于其陰性對照組［（23.89±1.89）%vs（16.6±1.14）%，t=4.677，P=0.009] ，而下調組肝癌SMMC-7721細胞凋亡率低于其陰性對照組［（14.98±0.46）%vs（17.79±0.73）%，t=4.633，P=0.010] ，見圖 5。

圖5 流式細胞儀檢測轉染后肝癌SMMC-7721細胞的凋亡情況Fig.5 Flow cytometry for cell apoptosis of liver cancer SMMC-7721 cells after transfection

3 討論

目前研究證實多種miRNA可通過激活或抑制癌基因及抑癌基因的表達參與腫瘤的生物學行為［10-11]，其對惡性腫瘤診斷及預后判斷等亦有一定價值［12-13]，因此miRNA研究成為腫瘤研究的熱點之一。多項研究表明miRNA參與肝癌發生發展，其中miR-33a低表達提示肝癌預后不良［14]，miR-1468可促進肝癌細胞增殖和細胞周期進程，誘導細胞凋亡［15]，miR-608亦可抑制肝癌細胞增殖［16]，而miR-644a高表達抑制肝癌細胞增殖并促進細胞凋亡［17]。KANG 等［18]在結腸癌細胞HT29、HcT116、T84 研究中發現，miR-4282 表達明顯低于正常結腸細胞CCD-18Co，而抑制miR-4282高表達可促進細胞增殖，認為其在結腸癌中發揮抑癌基因作用。基于目前對Hsa-miR-4282及miRNA相關研究，我們推測Hsa-miR-4282差異表達亦可能與肝癌發生發展有關，且在正常肝細胞中發揮抑癌基因作用。為此本研究采用實時熒光定量PCR檢測肝癌組織及其癌旁組織，以及肝癌細胞SMMC-7721、MHCC97-H和正常肝上皮細胞HL-7702中Hsa-miR-4282的表達，發現肝癌組織和肝癌細胞中Hsa-miR-4282表達量均降低，提示該分子可能參與肝癌的發生發展。

為進一步觀察Hsa-miR-4282表達變化對肝癌生物學行為的影響，本研究進行了體外細胞功能實驗。鑒于肝癌SMMC-7721細胞中Hsa-miR-4282的表達相對較高，故選擇該細胞株進行后續功能實驗。通過轉染Hsa-miR-4282模擬物和抑制物調控肝癌SMMC-7721細胞中Hsa-miR-4282的表達，然后采用MTT實驗檢測細胞增殖能力，發現下調Hsa-miR-4282表達可促進肝癌SMMC-7721細胞增殖能力，而上調Hsa-miR-4282表達抑制了細胞增殖能力。平板克隆形成實驗結果顯示，上調Hsa-miR-4282后肝癌SMMC-7721細胞克隆形成能力減弱，而下調其表達則克隆形成能力增強。凋亡實驗亦證實上調Hsa-miR-4282使肝癌SMMC-7721細胞凋亡率增加，促進細胞凋亡；而下調則使細胞凋亡率降低，抑制細胞凋亡。以上實驗結果提示Hsa-miR-4282是肝癌發生發展中的一個重要分子，其在肝癌中低表達可促使細胞增殖能力增強，但具體作用機制不明。有研究發現miR-197可直接靶向Axin-2、裸露的角質層 1（NKD1）和 Dickkopf相關蛋白2（DKK2），通過激活 Wnt/β-catenin 信號通路促進肝癌侵襲和轉移［19]。因此推測Hsa-miR-4282作用肝癌SMMC-7721細胞的途徑亦可能與miRNA調節靶基因mRNA的表達，進而影響細胞增殖及凋亡相關分子表達或激活相關通路有關。

綜上所述，本研究發現Hsa-miR-4282上調可抑制肝癌SMMC-7721細胞增殖，促進細胞凋亡，可能參與肝癌的發生發展，有望成為肝癌診斷的生物標志物。但本研究僅從細胞增殖、凋亡方面分析了該分子對肝癌細胞的影響，其對其他細胞功能的影響以及具體的作用機制有待進一步研究。