積雪草酸對人肝癌SMMC-7721細胞增殖和自噬的影響

蘇棋 王獻哲 梁聰 李媛媛 何萍

肝癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，我國肝癌的新發病例和死亡病例約占全球的50%，死亡率僅次于胃癌，而廣西肝癌的發病率和死亡率遠高于全國平均水平［1]。目前，肝癌治療主要有手術、化療和放療等，但均未能獲得滿意的療效，因此新型抗肝癌藥物的篩選仍是目前的研究熱點［2]。從天然產物中尋找有效的抗腫瘤藥物是醫藥研發領域的主要方向之一。積雪草（Centella asiatica（L）Urban）別名雷公根、崩大碗，野生資源極為豐富，廣泛分布于廣西各個縣市。積雪草酸（asiatic acid，AA）是積雪草中含量較高的烏蘇烷型五環三萜酸，具有抗炎、抗氧化、保肝、抗腫瘤等多種藥理作用［3]。AA抗瘤譜較廣，可通過誘導細胞凋亡，抑制乳腺癌、卵巢癌、結腸癌、多形性膠質母細胞瘤、非小細胞肺癌及人高分化肝癌HepG2細胞等多種組織來源腫瘤細胞增殖［4-7]。自噬和凋亡作為細胞程序性細胞死亡的2種途徑，在腫瘤的發生、發展中均發揮重要作用。自噬是腫瘤細胞凋亡缺陷下的另一個細胞死亡開關，近年一些靶向自噬的研究為抗腫瘤藥物研發提供了新方向［8]。本研究采用不同濃度AA作用于人低分化肝癌SMMC-7721細胞株，進一步探討AA的抗肝癌效應及其可能的自噬機制，以期為抗癌藥物研發提供新靶點。

1 材料與方法

1.1 主要藥品和試劑

AA標準品（HPLC≥98.6%）購自成都普瑞法科技有限公司，采用0.1%二甲基亞砜（DMSO）溶解AA。DMSO、自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-MA）和細胞增殖檢測試劑MTT均購自美國Sigma公司。自噬囊泡染色試劑單丹（磺）酰戊二胺（MDC）購自北京索萊寶公司，蛋白RIPA裂解液和BCA法蛋白定量試劑盒購自上海碧云天生物有限公司。LC3、p62、mTOR、p-mTOR、p53、GAPDH 等一抗購自美國Cell Signaling Technology公司，IRDye 680RD熒光二抗購自美國Li-Cor公司。

1.2 細胞培養

人低分化肝癌SMMC-7721細胞株由廣西醫科大學藥學院中心實驗室提供。在含10%胎牛血清的DMEM高糖培養液，37℃、5%CO2培養箱中常規培養，取對數生長期細胞進行后續實驗。

1.3 MTT法檢測人肝癌SMMC-7721細胞的增殖活性

將SMMC-7721細胞按5×103/孔接種于96孔板中培養24 h，設置0.1%DMSO為對照組。分別采用20 μmol/L、30 μmol/L、40 μmol/L、50 μmol/L、60 μmol/L的AA處理24 h后，加入5 mg/mL MTT再培養4 h，棄上清液，每孔添加100 μL DMSO以溶解甲贊晶體，用酶標儀測定490 nm處的吸光度（OD）值，計算各組細胞增殖抑制率后繪制細胞生長曲線及計算IC50，并根據IC50計算結果選取后續實驗的AA濃度。細胞增殖抑制率（%）=［（對照組OD值-實驗組OD值）/對照組OD值] ×100%。為觀察自噬抑制劑3-MA對AA抑制肝癌細胞增殖作用的影響，采用40 μmol/L AA聯合10 mmol/L自噬抑制劑3-MA共處理SMMC-7721細胞，24 h后采用MTT法測定細胞增殖抑制率，同時設AA單獨給藥組和10 mmol/L 3-MA給藥組作為對照。實驗重復3次。

1.4 MDC染色法檢測人肝癌SMMC-7721細胞自噬泡的形成

將SMMC-7721細胞按8×105/孔接種于6孔板中，設置0.1%DMSO為對照，用40 μmol/L AA處理24 h后，PBS洗滌2次，加入50 μmol/L MDC室溫下避光培養20 min，洗滌2次，在4%多聚甲醛中固定20 min，熒光顯微鏡下觀察紫外光激發下的MDC熒光變化。實驗重復3次。

1.5 Western blot檢測人肝癌SMMC-7721細胞自噬相關蛋白的表達

將SMMC-7721細胞按8×105/孔接種于6孔板中，設置0.1%DMSO為對照，采用40 μmol/L AA處理24 h后，PBS洗滌2次，用RIPA裂解液提取細胞蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白質濃度。7.5%～12.5%SDS-PAGE電泳分離蛋白、轉膜，蛋白封閉液封閉1 h。加 LC3-I、LC3-II、p62、mTOR、p-mTOR、p53 及 GAPDH 等一抗并以推薦濃度于4℃孵育過夜；次日用TBST洗膜液洗膜3次后加入IRDye 680RD熒光二抗（1∶10 000），室溫孵育60 min。采用ODYSSEY系統和掃膜儀觀察條帶并測量條帶灰度值，以樣本和內參GAPDH的比值作為蛋白相對表達量。實驗重復3次。

1.6 統計學方法

采用SPSS 22.0進行數據分析。實驗中的計量數據數據以均數±標準差（±s）表示；多樣本組間均數的比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），若整體差異有統計學意義，進一步的兩兩比較采用LSD檢驗；兩樣本均數的比較采用獨立樣本t檢驗進行分析；采用一般線性回歸模型分析AA對細胞抑制率的濃度依賴性。以雙側P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 AA對人肝癌SMMC-7721細胞增殖的影響

MTT實驗結果表明，不同濃度AA孵育24 h后均可抑制SMMC-7721細胞的增殖，對抑制率和AA濃度進行線性回歸分析后，表明AA的抑制作用具有濃度依賴性（F=46.790，P=0.006），見圖 1。IC50=37.313μmol/L，根據IC50計算結果，采用40 μmol/L AA進行后續實驗。

圖1 不同濃度AA處理24 h對人肝癌SMMC-7721細胞增殖的影響Fig.1 Effect of different concentrations of AA for 24 h on cell proliferation of human hepatoma SMMC-7721 cells

2.2 自噬抑制劑3-MA對AA抑制人肝癌SMMC-7721細胞增殖作用的影響

如圖2所示，10 mmol/L 3-MA作用后細胞抑制率為（19.000±4.637）%，40 μmol/L AA 作用后細胞抑制率為（46.400±9.099）%，10 mmol/L 3-MA 與 40 μmol/L AA聯用組作用后細胞抑制率為（22.000±3.391）%，組間抑制率比較差異有統計學意義（F=29.256，P＜0.001）。進一步多重比較發現，與40 μmol/LAA單獨作用相比，聯用組的細胞增殖抑制率明顯降低（P＜0.001）；聯用組與10 mmol/L 3-MA單獨作用相比，細胞增殖抑制率差異無統計學意義（P=0.460）。

圖2 自噬抑制劑3-MA對AA抑制人肝癌SMMC-7721細胞增殖作用的影響Fig.2 Influence of autophagy inhibitor 3-MA on antiproliferation effect of AA in human hepatoma SMMC-7721 cells

2.3 AA對人肝癌SMMC-7721細胞自噬泡形成的影響

MDC染色結果在熒光顯微鏡下可見，DMSO對照組細胞內存在散在綠色熒光點；40 μmol/L AA處理24 h后，SMMC7721細胞MDC染色標記的熒光顆粒明顯增多并聚集成團塊狀，且熒光強度明顯增強，表明AA能增加自噬泡的形成。見圖3。

圖3 MDC染色觀察AA對人肝癌SMMC-7721細胞自噬泡形成的影響（×400）Fig.3 Effect of AA on the formation of autophagic vacuoles of human hepatoma SMMC-7721 cells by MDC staining（×400）

2.4 AA對人肝癌SMMC-7721細胞自噬相關蛋白表達的影響

Western blot檢測結果顯示，與對照組相比，40 μmol/L AA處理24 h能明顯降低LC3-I的蛋白表達和提高LC3-Ⅱ蛋白表達，p62蛋白和p-mTOR蛋白表達降低，但對mTOR和p53蛋白表達無明顯影響。見圖4、表1。

表1 AA對人肝癌SMMC-7721細胞自噬相關蛋白表達的影響［（±s），n=3] Tab.1 Effects of AA on the relative expression levels of autophagy-related proteins of human hepatoma SMMC-7721 cells［（±s），n=3]

表1 AA對人肝癌SMMC-7721細胞自噬相關蛋白表達的影響［（±s），n=3] Tab.1 Effects of AA on the relative expression levels of autophagy-related proteins of human hepatoma SMMC-7721 cells［（±s），n=3]

Relative expression of proteins LC3-I LC3-II p62 mTOR Group p-mTOR p53 Control 1.744±0.108 0.113±0.031 0.522±0.024 1.713±0.111 40 μmol/L AA 1.529±0.065 0.380±0.036 0.123±0.019 1.556±0.076 t 2.928 -9.754 22.565 1.555 P 0.043 ＜0.001 ＜0.001 0.190 1.252±0.039 0.671±0.040 0.353±0.028 0.726±0.055 30.775 -1.555＜0.001 0.210

圖4 Western blot檢測AA對人肝癌SMMC-7721細胞自噬相關蛋白表達的影響Fig.4 EffectsofAA on theexpression ofautophagy-related proteins of human hepatoma SMMC-7721 cells by Western blot

3 討論

目前腫瘤化療藥物大多通過誘導腫瘤細胞凋亡發揮抗腫瘤效應，但因腫瘤發病機制與細胞凋亡功能缺陷有關，導致腫瘤對化療藥物的敏感性存在很大差異，因此尋求凋亡以外的替代或聯合治療方案迫在眉睫［8]。積雪草酸是傳統壯藥積雪草的主要活性成分之一，研究發現AA具有巨大的抗癌潛力，但目前對AA作用于肝癌的作用方式及機制報道較少。本研究采用不同濃度AA作用人低分化肝癌SMMC-7721細胞株，MTT檢測結果發現，不同濃度AA作用24 h后均可抑制細胞增殖，且呈濃度依賴性，說明AA發揮了抑制肝癌SMMC-7721細胞的作用，但具體作用機制不明。

自噬常被饑餓、蛋白質聚集和其他形式應激（如氧化應激）誘導，而肝癌細胞的高繁殖能力可導致持續性的炎癥和高氧化應激，從而誘導自噬。研究發現自噬在肝癌發生、發展中發揮關鍵作用，且具有抑制或促進肝癌的雙重性。自噬誘導劑和自噬抑制劑在肝癌治療中凸顯巨大潛力，自噬誘導劑索拉非尼是目前臨床的一線抗肝癌藥物，而自噬抑制劑3-MA和氯喹則可抑制肝癌腫瘤生長［9]。耿驥等［10]研究發現AA可誘導人HCT116結腸癌細胞增殖并誘導自噬。WU等［6]報道AA可在人A549非小細胞肺癌細胞株誘導保護性自噬。本研究基于AA作用的IC50為37.31 μmon/L，故選取40 μmon/L AA聯合自噬抑制劑3-MA作用肝癌SMMC-7721細胞，結果發現與單獨40 μmon/L作用比較，聯合作用后細胞增殖抑制率顯著降低，但與10 mmol/L 3-MA單獨作用相比，聯用組細胞增殖抑制率無明顯變化，說明3-MA可部分逆轉AA對SMMC-7721細胞增殖的抑制作用，認為AA可能通過誘發自噬而抑制SMMC-7721細胞增殖。

MDC是自噬囊泡示蹤劑，能與自噬囊泡膜上的泛素樣結合系統（Atg8）特異性結合，尤其對處于物質降解階段的晚期自噬有特異性［11]。LC3是公認的自噬標志物，自噬形成時，胞漿型LC3（即LC3-I）可酶解掉一小段多肽，轉變為膜型自噬體LC3（即LC3-Ⅰ），LC3-Ⅱ的含量與自噬程度成正比，而LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值可估計自噬水平的高低［8]。自噬底物蛋白p62是泛素結合蛋白，在多種細胞和組織均表達，與自噬活性成反比，可間接反映自噬活性。為進一步觀察AA如何影響自噬，本研究進行細胞MDC染色實驗，結果發現40 μmol/L AA處理24 h可明顯增加自噬泡的形成；Western blot檢測自噬標志物LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ及p62蛋白的表達，發現與對照組比較，40 μmon/L AA處理24 h后可明顯降低SMMC-7721細胞LC3-Ⅰ表達和提高LC3-Ⅱ表達，降低p62的表達，表明AA作用后提高了LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值，可誘導SMMC-7721細胞發生自噬。

mTOR信號通路是調節細胞增殖、凋亡和自噬最重要的信號通路之一，受PI3K/Akt、AMPK等多個上游信號通路調控［12]。活化的mTOR可磷酸化ULK1和ATG13，使自噬啟動因子ULK1-ATG13-FIP2000復合體失去活性而發揮抑制自噬的作用［8]。本研究中，40 μmol/L AA處理24 h后可明顯降低SMMC-7721細胞和p-mTOR蛋白的表達，表明AA可能通過負調控mTOR通路誘發SMMC-7721細胞產生自噬，但尚需聯合該通路的激活劑和抑制劑進一步驗證。

抑癌基因p53基因是凋亡激活因子，研究發現p53也參與自噬的調節［13]。p53蛋白因其細胞內定位不同而功能各異，在細胞核內可促進自噬，而在細胞質中主要發揮抑制作用，且多與mTOR信號轉導通路有關［14]。本研究并未發現AA對p53蛋白的表達有顯著影響，推測AA可能通過非p53依賴方式誘導SMMC-7721細胞產生自噬。

綜上所述，本研究發現AA能抑制人肝癌SMMC-7721細胞增殖，可能與其通過非p53依賴的方式負調控mTOR通路誘發自噬有關，AA有望作為抗肝癌的新靶點，后續將聯合應用多種自噬抑制劑及信號通路抑制劑、激動劑，并從細胞和動物多方面進一步深入探討AA誘發自噬與其抗肝癌作用的關系及其作用機制。