ACCα在肝細胞癌中的表達及對細胞生長的影響

梁寧 王謙 黃倩 李仁志 楊濤 楊懿 黃小軍 何顯力

肝癌是我國發病率和死亡率均較高的惡性腫瘤之一，其中70%～90%的原發性肝癌是肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）［1]。目前盡管診療技術不斷發展，但HCC患者的5年生存率仍未得到明顯改善［2]，發病機制亦未清楚。HANAHAN等［3]詳細闡述了腫瘤的十大特征，其中之一便是代謝重編程。而在腫瘤細胞中明顯的代謝特征是脂肪酸從頭合成增加［4]。乙酰輔酶 A 羧化酶 α（acetyl CoA carboxylase alpha，ACCα）是調控脂肪酸合成的限速酶，也是催化脂肪酸合成的第一步反應，可用于乙酰輔酶A的ATP依賴性羧化作用而生成丙二酰輔酶A［5]，在脂肪酸代謝中具有重要作用。本研究通過qRT-PCR及Western blot實驗檢測ACCα在HCC組織及其相應癌旁正常組織中的表達，同時采用siRNA下調HCC細胞中ACCα的表達水平，觀察ACCα表達改變對HCC細胞增殖、細胞周期和凋亡能力的影響，為HCC治療尋找新的靶點。

1 材料與方法

1.1 主要材料及試劑

人 HCC 細胞株 SNU-739、SNU-368、HLE、HLF 購自南京科佰生物公司，人HCC細胞株SNU-878、BEL-7402、MHCC-97L購自中國科學院上海細胞庫。胎牛血清購自BBI Life Sciences公司，青鏈霉素混合液購自中國索萊寶公司，RPMI 1640培養基及DMEM高糖培養基購自中國瑞博公司，Lipofectamine 2000 Transfection Reagent購自美國Invitrogen公司，Opti-MEM購自美國Gibco公司，BCA蛋白定量試劑盒購自中國Beyotime公司，大分子量蛋白Marker購自美國Thermo Fisher公司，Total RNA Kit、反轉錄試劑盒、SYBR Green PCR Kit購自美國Takara公司，細胞周期檢測試劑盒、細胞凋亡檢測試劑盒購自中國貝博公司，MTS細胞活力檢測試劑盒購自美國Promega公司，β-actin抗體購自北京天德悅公司，ACCα抗體購自美國Abcam公司。

1.2 組織樣本

收集2015年12月至2018年6月于空軍軍醫大學唐都醫院行根治性手術的30例HCC患者癌組織及其相應癌旁正常組織標本。標本由空軍軍醫大學教學實驗中心組織樣本庫于-80℃冰箱保存。所有患者臨床信息完整、術前未接受放療或化療等輔助治療、組織質量高、病理分型均為HCC，其中男性22例，女性8例，平均年齡61歲。本研究通過空軍軍醫大學唐都醫院醫學倫理委員會批準，患者簽署知情同意書并備案。

1.2 細胞培養和瞬時轉染

人 HCC 細胞 SNU-739、SNU-368、SNU-878、BEL-7402用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基，人HCC細胞HLE、HLF、MHCC-97L用加入10%胎牛血清的DMEM培養基置于37℃、5%CO2培養箱中培養。消化處于對數期的SNU-368細胞，以3×104個/孔接種于6孔板，至細胞融合達75%～85%時進行轉染，將6孔板內培養液更換為Opti-MEM培養基（1.5 mL/孔），置于37℃、5%CO2培養箱20 min。計算需轉染孔數量，每孔需8 μL 20 μmol/L siRNA 和 8 μL Lipofectamine 2000 并分別加入250 μL Opti-MEM培養基，將以上2種液體混勻，靜置20 min，取液體500 μL/孔，加入 6孔板，置于37℃、5%CO2培養箱繼續培養6 h，然后棄去轉染液，更換新鮮完全培養基培養，48 h后消化細胞并收集，進行后續實驗。

1.3 qRT-PCR檢測HCC組織及癌旁正常組織中ACCα mRNA的表達

根據Total RNA Kit說明書提取30例HCC患者癌組織及其相應癌旁正常組織樣本總RNA，用蛋白定量儀測定OD值，按照反轉錄試劑盒將已測完濃度的RNA反轉錄為cDNA，采用SYBR熒光染料法反應體系進行實時定量檢測ACCα mRNA的表達，GADPH作為內參。GADPH上游引物：5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3'，下游引物：3'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-5'；ACCα 上游引物：5'-AGGAAGATGGTGTCCGCTCTG-3'，下游引物：3'-GGGGAGATGTGCTGGGTCAT-5'。qRT-PCR反應條件：95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 3 min進行35個循環。采用2-△△Ct計算ACCα mRNA表達量，每個樣本至少設置3個復孔，實驗重復3次。

1.4 Western blot檢測HCC組織及癌旁正常組織中ACCα蛋白的表達

提取30例HCC癌組織及其相應癌旁正常組織樣本總蛋白做ACCα癌-癌旁表達前期驗證，消化收集7 種 HCC 細胞（SNU-739、SNU-368、HLE、HLF、SNU-878、BEL-7402、MHCC-97L）并提取總蛋白篩選后續實驗細胞，消化收集轉染ACCα siRNA及陰性對照的SNU-368細胞，提取蛋白進行ACCα轉染效果驗證，BCA試劑盒測定蛋白濃度。每孔蛋白上樣量40 μg，以80 V恒壓電泳約80 min，濕轉法將蛋白轉至PVDF膜上，5%TBST脫脂奶粉封閉1 h，加入1∶3 000稀釋比例 ACCα、β-actin一抗4℃冰箱孵育過夜；于室溫孵育二抗2 h，ECL顯影。采用ImageJ軟件對Western blot條帶進行灰度分析，蛋白表達量=目的蛋白的灰度值/內參蛋白的灰度值。實驗重復3次。

1.5 MTS法檢測轉染后HCC SNU-368細胞的增殖能力

分別消化收集轉染48 h的SNU368-siCtrl、SNU368-siACCα-1及SNU368-siACCα-2細胞，調整細胞密度至1×103個/100 μL，加入96孔板，分別種8個復孔，周圍加同樣體積的完全培養基，相同方法準備5板待測樣板，細胞貼壁后加入20 μL/孔MTS工作液，置于37℃、5%CO2培養箱繼續孵育1 h。酶聯免疫檢測儀于490 nm波長處檢測各孔的吸光度（OD）值，記錄數據記為 0 h，同樣方法分別于 24 h、48 h、72 h、96 h檢測剩余4板樣品孔OD值并記錄，繪制細胞生長曲線。細胞活力計算：將各測試孔的OD值減去調零孔OD值，重復孔的OD值取平均數。

1.6 流式細胞儀檢測轉染后HCC SNU-368細胞周期的分布情況

分別消化收集轉染48 h的SNU368-siCtrl、SNU368-siACCα-1及SNU368-siACCα-2細胞，1×PBS洗滌2次，移入1.5 mL EP管，棄上清液，分別加入75%冰乙醇吹打混勻，于4℃冰箱固定1 h，4℃預冷1×PBS洗滌，棄上清液。用400 μL 1×PBS重懸細胞，分別加入Rnase A 溶液 20 μL 37 ℃水浴 30 min，加入 400 μL PI染液，送流式細胞儀于488 nm激發波長處進行分析。細胞周期分布百分比由Flowjo軟件分析。

1.7 流式細胞儀檢測轉染后HCC SNU-368細胞凋亡情況

無EDTA胰酶分別消化收集轉染48 h的SNU368-siCtrl、SNU368-siACCα-1 及 SNU368-siACCα-2 細胞，1×PBS洗滌2次，移入1.5 mL EP管，棄去上清液，分別加入 400 μL 1×Binding Buffer重懸細胞，再加入 5 μL Annexin V-FITC，輕搖混勻后于4℃冰箱孵育15 min，最后加入10 μL PI混勻后于4℃冰箱避光孵育5 min，立即送流式細胞儀于488 nm激發波長處進行分析。凋亡細胞百分比=早期凋亡百分比（B4象限）+晚期凋亡百分比（B2象限）。

1.8 統計學方法

采用SPSS 17.0軟件進行統計學分析。單因素方差分析比較各組細胞增殖率、細胞周期分布、細胞凋亡率的差異，若整體差異有統計學意義，進一步的兩兩比較采用LSD-t檢驗；采用配對t檢驗分析HCC組織和癌旁正常組織ACCα表達的差異。以雙側P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HCC組織中ACCα蛋白和mRNA的表達

Western blot檢測結果顯示，與相應癌旁正常組織相比，HCC組織中ACCα蛋白表達水平明顯升高，其中ACCα蛋白高表達24例，表達無差異3例，低表達3例，見圖1A。HCC組織和癌旁正常組織ACCα蛋白表達量分別為3.26±0.81和1.88±0.64，差異有統計學意義（P=0.021）。qRT-PCR檢測結果顯示，HCC和癌旁正常組織中ACCα mRNA表達量分別為3.41±0.71和 1.74±0.54，差異亦有統計學意義（P=0.019），見圖1B。

圖1 肝細胞癌組織及其癌旁正常組織中ACCα的表達情況Fig.1 Expressionof ACCα inHCC tissuesandadjacent normal tissues

2.2 不同HCC細胞中ACCα蛋白的表達水平

Western blot檢測結果顯示，HCC SNU-739、SNU-368、HLE、HLF、SNU-878、BEL-7402 和 MHCC-97L 細胞中 ACCα 蛋白的表達量分別為 0.90±0.03、0.09±0.05、0.87±0.07、0.21±0.03、0.15±0.04、0.39±0.06 和 0.43±0.05，差異有統計學意義（F=47.640，P＜0.001），其中SNU-368細胞中ACCα的蛋白表達水平最高，見圖2。

圖2 Western blot檢測不同HCC細胞中ACCα蛋白的表達情況Fig.2 Expression of ACCα in different HCC cell lines detected by Western blot

2.3 轉染后HCC SNU-368細胞中ACCα蛋白的表達水平

本研究設計合成2條ACCα干涉片段siRNA，通過瞬時轉染siRNA方法對HCC SNU-368細胞進行瞬時轉染，48 h后收集細胞，Western blot驗證瞬時轉染的干涉效果，結果顯示SNU368-siCtrl組、SNU368-siACCα-1組和SNU368-siACCα-2組蛋白表達量分別為 0.94±0.05、0.28±0.08 和 0.19±0.09，3 組比較差異有統計學意義（F=63.680，P=0.015），其中 SNU368-siACCα-1組和SNU368-siACCα-2組分別與SNU368-siCtrl組比較差異均有統計學意義（P＜0.01）。提示干涉ACCα的HCC細胞系構建成功，見圖3。

圖3 Western blot檢測轉染后HCC SNU-368細胞中ACCα蛋白的表達水平Fig.3 Expression of ACCα in HCC SNU-368 cells after transfection detected by Western blot

2.4 下調ACCα后HCC SNU-368細胞的增殖能力

MTS實驗檢測結果顯示，SNU368-siCtrl組、SNU368-siACCα-1組和 SNU368-siACCα-2處理 96 h的 OD 值分別為（0.84±0.08）%、（0.49±0.06）%和（0.53±0.06）%，3組比較差異有統計學意義（F=42.140，P=0.001），其中 SNU368-siACCα-1 組和 SNU368-siACCα-2組分別與SNU368-siCtrl組比較，差異均有統計學意義（P＜0.01），見圖4A。

2.5 流式細胞術檢測細胞周期及凋亡情況

流式細胞術檢測結果顯示，G1期SNU368-siCtrl組、SNU368-siACCα-1組和SNU368-siACCα-2組細胞占比分別為（55.78±0.50）%、（65.38±0.58）%和（63.30±0.44）%，3組比較差異有統計學意義（F=298.313，P＜0.01），且SNU368-siACCα-1組和SNU368-siACCα-2組分別與SNU368-siCtrl組比較差異有統計學意義（P=0.004，0.004）。S 期 SNU368-siCtrl組、SNU368-ACCα-1組和SNU368-siACCα-2組細胞占比分別為（26.24±1.04）%、（18.91±0.36）%和（19.96±0.55）%，3組間比較差異有統計學意義 （F=93.570，P＜0.01），SNU368-siACCα-1組和 SNU368-siACCα-2組分別與SNU368-siCtrl組比較差異有統計學意義（P=0.004，0.017）。G2/M 期 SNU368-siCtrl組、SNU368-siACCα-1組和SNU368-siACCα-2組細胞占比分別為（17.98±1.39）%、（15.70±0.22）%和（16.74±0.15）%，3 組間比較差異無統計學意義（F=5.831，P=0.390），說明與SNU368-siCtrl相比，SNU368-siACCα-1 及 SNU368-siACCα-2轉染組G0/G1期細胞占比明顯增加，S期細胞占比降低，見圖4B。

流式細胞術檢測細胞凋亡情況，結果顯示，SNU368-siCtrl組、SNU368-siACCα-1 組和 SNU368-siACCα-2組的細胞凋亡率分別為（6.57±1.19）%、（19.47±1.14）%和（16.73±0.91）%，3組比較差異有統計學意義（F=117.500，P=0.005），其中 SNU368-siACCα-1組和SNU368-siACCα-2組分別與SNU368-siCtrl組比較差異有統計學意義（P=0.002，0.003），提示與SNU368-siCtrl相比，SNU368-ACCα-1 及 SNU368-si2轉染組的細胞總凋亡率明顯增加，且以早期凋亡為主，見圖4C。

圖4 下調ACCα對HCC SNU-368細胞生長的影響Fi g.4 Effects on HCC SNU-368 cells proliferation after downregulation of Accα

3 討論

近年來ACCα在腫瘤中的作用受到了廣泛關注，多項研究表明ACCα在多種腫瘤組織中表達升高。RIOS GARCIA等［6]研究發現ACCα在乳腺癌轉移灶中的表達水平顯著上調，且與患者的不良預后相關。在前列腺癌中亦發現ACCα表達升高，且干涉ACCα后前列腺癌細胞的脂酸合成被顯著抑制，同時腫瘤細胞發生周期阻滯和凋亡［7-8]。有研究報道ACCα可促進人膠質母細胞瘤增殖，并抑制細胞凋亡［9]。在非小細胞肺癌組織中ACCα表達同樣升高，而使用ACCα靶向抑制劑ND-646可使腫瘤生長速度變緩，小鼠生存期延長［10]。此外，基因多態性研究證實ACCα基因調控區PⅢ的多態性可影響ACCα表達，且增加了乳腺癌和卵巢癌的發病風險［11]。本課題組前期的流行病學研究也發現ACCα不同基因型可顯著影響肺癌術后患者的預后［12]。本研究采用 Western blot和qRT-PCR檢測30例HCC患者癌組織及其癌旁正常組織中ACCα的表達水平，結果發現其在HCC組織中的表達水平顯著高于癌旁正常組織，提示ACCα在HCC組織中高表達并可能促進其惡性進展。

細胞增殖是生命的基本特征，個體發育、組織修復以及種群繁衍都與細胞增殖密切相關，細胞增殖受多種機制調控。腫瘤細胞最重要的特征是具備無限增殖的能力，即具有“永生化”特征。為驗證ACCα對HCC細胞生長是否發揮調控作用，本研究選取ACCα蛋白表達水平較高的HCC SNU-368細胞，進一步在體外細胞水平分析其對HCC細胞生長的影響，結果發現ACCα具有顯著促進HCC細胞增殖的作用，然而目前ACCα促進HCC細胞增殖的機制尚未完全闡明。LALLY等［13]發現ACCα可通過增加脂肪酸的從頭合成促進HCC進展，而使用ACCα特異性抑制劑ND-654則可抑制HCC發生。脂肪酸合成對腫瘤的發生發展具有重要意義，ACCα作為脂肪酸合成的限速酶，可將乙酰輔酶A羧化成丙二酰輔酶A，進而參與長鏈脂肪酸的合成［5]。腫瘤細胞通過合成大量脂肪酸，為其快速分裂增殖提供了充足的脂類大分子物質［14]。此外，脂肪酸的多種衍生物，如溶血磷脂酸、人前列腺素E2、磷脂酸等在調控細胞生存、增殖和轉移等亦發揮重要作用［4]。CHAKRABORTY 等［15]研究發現下調ACCα可抑制脂酸合成，并促進人卵巢癌細胞凋亡。ZHAN等［16]研究報道ACCα通過促進細胞膜磷脂合成而促進結直腸癌細胞增殖。有研究者還報道ACCα可促進肉毒堿棕櫚酰基轉移酶1A在線粒體中的定位，進而促進脂肪酸氧化，維持腫瘤細胞在能量應激下生存［17]。由此可見，ACCα通過促進脂肪酸的從頭合成可能是其促進HCC發展的重要機制之一。

細胞周期失控也是導致腫瘤細胞無限增殖的重要原因。細胞周期受體內外多種因素的共同作用，其中周期蛋白依賴性CDK激酶是細胞周期的重要調控因子。此外各種檢查點也可影響細胞周期進程，如限制點（R點）可調控細胞周期由G1期向S期轉變。任何理化因素或生物因素均可影響R點的功能，進而改變細胞周期，從而加速腫瘤細胞的增殖［18]。本研究結果顯示，干涉ACCα表達后HCC SNU-368細胞的生長速度明顯變慢，細胞發生G1期阻滯，S期細胞數明顯減少，細胞早期凋亡比例顯著上升。SVENSSON等［10]同樣發現干涉肺癌細胞ACCα的表達后，細胞發生G0/G1期阻滯，S期和G2/M期細胞數明顯減少，與本研究結論一致。然而ACCα具體通過何種機制影響細胞周期目前尚不明確，還需進一步研究。

綜上所述，本研究發現HCC細胞SNU-368中ACCα表達顯著上調，可能通過誘導細胞周期進程并抑制細胞凋亡促進HCC細胞增殖，ACCα有望作為HCC治療的潛在靶點。