中國唇腭裂患者Sonic hedgehog信號通路相關單核苷酸多態性的分析

張杰鈮，宋鳳岐，周紹楠，鄭 暉，彭麗穎，張 倩，趙望泓，張韜文，李巍然，周治波，林久祥△，陳 峰△

(1. 北京大學口腔醫學院·口腔醫院，正畸科 國家口腔疾病臨床醫學研究中心 口腔數字化醫療技術和材料國家工程實驗室 口腔數字醫學北京市重點實驗室, 北京 100081； 2. 北京大學口腔醫學院·口腔醫院中心實驗室，北京 100081； 3. 南方醫科大學南方醫院口腔科，廣州 510000； 4. 煙臺市口腔醫院口腔正畸科，山東煙臺 264000； 5. 北京大學口腔醫學院·口腔醫院口腔頜面外科，北京 100081)

唇腭裂是人類最常見的先天性發育畸形之一，同時也是口腔頜面部最常見的發育畸形，不僅影響患兒容貌，也會對患兒的發音、咀嚼和吞咽等產生不良影響。臨床上根據是否伴有其他系統畸形或先天發育異常將其分為綜合征型唇腭裂和非綜合征型唇腭裂(non-syndromic cleft lip and/or palate, NSCL/P)。NSCL/P在國內活產兒中的發病率大約為1.62‰[1]，高于西方國家1.42‰的發病率[2]。

從病因學角度來看，NSCL/P受多基因影響且與環境因素有關[3]。通常認為影響胚胎發育，調控頜面部或腭板相關細胞的增殖、分化、凋亡的基因與唇腭裂的相關性更高。研究證實多個基因與唇腭裂相關[4-5]，不同的信號通路均參與調控唇腭部的發育[6]，然而具體調控機制目前尚無定論。迄今為止與胚胎早期發育相關的多個基因和信號通路已被證實在NSCL/P的發生中發揮作用，我們此前的研究顯示血清中RBP4表達水平的下降和維生素A缺乏與新生兒的唇腭裂有關[7]。

在眾多信號通路中，Sonic hedgehog(Shh)信號通路在生長發育尤其是胚胎早期發育過程中扮演著重要角色[8-9]。Shh信號通路影響脊椎動物早期發育階段的細胞行為[10]、胚胎分化、組織發育和器官形成[8]。在早期胚胎發育過程中，Shh首先出現在中胚層[11]，人或鼠的Shh信號通路變異會導致神經板形成異常[12-13]。Shh信號通路包括分泌蛋白Hedgehog(HH)，跨膜蛋白受體Patched-1(PTCH1)，跨膜蛋白Smoothened(SMO)以及下游的轉錄因子GLI1、GLI2、GLI3[14]。在致病基因的相關研究中，單核苷酸多態性(single-nucleotide polymorphism, SNP)是最常見的基因影響疾病發生發展的方式之一[15]。此外標簽SNP在研究中日益廣泛的應用使得SNP的檢測更加高效，成本更低[16]。本研究采取基于SNP分析的方法檢測Shh信號通路在NSCL/P和健康人群之間的差異，以期找到其與NSCL/P的關聯。

1 資料與方法

1.1 病例收集與對照

病例收集自全國多中心的口腔醫院(包括重慶、甘肅、山東)。病例組為100例均已經過完善的臨床檢查并確診為NSCL/P的患病者，無其他出生缺陷。對照組為97例未患NSCL/P也無其它出生缺陷的健康人群。本研究獲得北京大學口腔醫院生物醫學倫理委員會審查批準(批件號：PKUSSIRB-201520012)， 由納入本研究的未成年對象的監護人簽署知情同意書。

1.2 選擇標簽SNP

基于國際人類基因組單體型圖計劃中中國北京漢族人口數據，使用Haploview軟件(ver.4.2, Mark Daly博士實驗室, 美國)進行單倍體型分析和標簽SNP選擇。針對Shh 信號通路中的4個候選基因SHH、PTCH1、SMO和GLI2共設計了27個SNP。所選擇的SNP基本涵蓋了候選基因的潛在功能性SNP，其最小等位基因頻率(minor allele frequency, MAF)>0.05：GLI273.5%,PTCH191.0%,SMO100.0%,SHH75.0%。

1.3 基因型檢測

使用基因組DNA提取試劑盒(天根公司，北京)從外周血樣中提取基因組DNA。采用Mass-ARRAY分子量陣列技術進行多重引物和PCR設計，并結合基于基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜技術 (matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight, MALDI-TOF)的Sequenom質譜檢測技術(Sequenom公司, 美國)[17]，檢測27個SNP位點在4個候選基因的基因型。所有基因型檢測結果經過重復驗證以保證結果的準確性，一致性達到95%。

1.4 統計學分析

計數資料(等位基因、基因型分布頻率等)采用成組設計四格表資料的卡方檢驗進行比較。計算每個SNP在病例組和對照組中出現的比值比(odds ratio，OR)和95%置信區間(confidence interval，CI)表示關聯強度。對基因型頻率與唇腭裂的相關性進行多重檢驗，包括Logistic線性回歸模型[18]，同時使用Bonferroni校正以降低假陽性率。病例組和對照組中每個SNP都通過基因型分布頻率的卡方檢驗進行哈迪-溫伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium，HWE)分析。并使用軟件Haploview(http://www.broad.mit.edu/mpg/haploview;[19])進行連鎖不平衡統計。

2 結果

2.1 SNP等位基因及基因型頻率在病例組和對照組之間的比較分析

27個SNP中，檢出率超過90%的有25個，另外兩個位于GLI2的rs4848122 和rs17390009的檢出率分別為76.6%和78.2%被剔除。27個SNP的MAF如表1所示，所有SNP的HWE檢驗分析數據見表2(P>0.01)。我們使用卡方檢驗(表3)和Logistic回歸分析(表4)對等位基因進行統計，得出疾病組與對照組的差異無統計學意義。然而對基因型的病例對照分析則顯示rs12674259(SMO)和rs2066836(PTCH1)的基因型頻率在病例組和對照組之間的差異有統計學意義(表5)，這兩個位點的分布頻率和質譜峰值如圖1所示。

表1 27個SNP的最小等位基因頻率Table 1 Minor allele frequencies of SNP in samples

CHR, chromosome; SNP, single-nucleotide polymorphism; A1, minor allele; A2, major allele; NCBI, National Coalition Building Institute; MAF, minor allele frequency.

2.2 候選基因的連鎖不平衡分析

在4個候選基因所位于的3條目標染色體(第2、7、9號染色體)中均發現了連鎖不平衡(圖2)。在連鎖不平衡單倍體型分析中，病例組和對照組之間的差異無統計學意義。

2.3 rs12674259和rs2066836的位點功能預測

本研究顯示rs12674259和rs2066836位點頻率在病例組和對照組中的差異具有統計學意義。rs2066836位點位于PTCH1基因的外顯子區，針對該SNP位點進行的預測分析表明，其多態性可能會影響基因外顯子區剪接位點的功能，進而改變剪接與轉錄過程。

表2 27個SNP的哈迪-溫伯格平衡檢驗結果Table 2 Tests of HWE for all SNP

CHR, chromosome; SNP, single-nucleotide polymorphism; A1, minor allele; A2, major allele; GENO, genotype.

與PTCH1類似，SMO也是Shh信號通路中的一個跨膜蛋白受體， rs12674259定位在內含子區，該位點可能是MIT/TFE3轉錄因子的結合位點，其多態性可能會通過轉錄因子結合位點的改變而影響基因轉錄。

表3 對照組和病例組的SNP卡方檢驗Table 3 Chi-squared analysis of allele in controls and NSCL/P patients

SNP, single-nucleotide polymorphism; A1, minor allele; A2, major allele;SE, standard error; CHISQ, chi-square test.

3 討論

此前有研究顯示綜合征型唇腭裂與單個基因突變有關，其中包括組成Shh信號通路的GLI2、GLI3、PTCH1和SHH，所以我們選擇覆蓋這4個候選基因的標簽SNP進行檢測，以探究在中國人群中Shh信號通路是否也與NSCL/P相關。本研究中我們分析了Shh信號通路中4個基因的27個SNP位點，并發現了PTCH1的SNP位點rs2066836和SMO的SNP位點rs12674259與唇腭裂相關。

PTCH1是顱頜面發育的重要調控因子，其單倍劑量不足可能會引發成釉細胞瘤[20]。另外，PTCH1突變可以導致唇腭裂的發生[21]。此前有研究顯示位于PTCH1的SNP位點rs2066836與一個愛爾蘭人群中唇腭裂的發生相關[22]。本研究表明這一位點與中國人群中唇腭裂發病相關。我們對該SNP位點進行功能預測，發現它是外顯子區的多態性，可能會影響外顯子區剪接位點的增加或缺失，改變剪接與轉錄過程，進而影響基因表達水平。

表4 病例組和對照組的Logistic回歸分析Table 4 Logistic tests of association in controls and NSCL/P patients

CHR, chromosome;SNP, single-nucleotide polymorphism; A1, minor allele; A2, major allele;SE, standard error.

表5 病例組與對照組的統計關聯Table 5 Association statistics of the NSCL/P and control panels

SNP, single-nucleotide polymorphism; NSCL/P, non-syndromic cleft lip and/or palate;P(Logistic), ajusted with gender;P(Bonferroni), ajus-tedPvalue by Bonferroni correction;P(HWE), ajustedPvalue by HWE test; HWE, Hardy-Weinberg equilibrium.

圖1 rs2066836和rs12674259的Sequenom質譜測序結果Figure 1 Distribution frequency and multiplex polymerase chain reaction

圖2 4個候選基因GLI2(2q14)、 SMO(7q32)、 SHH(7q36)和 PTCH1(9q22)的連鎖不平衡分析Figure 2 Linkage disequilibrium blocks in the GLI2(2q14), SMO(7q32), SHH(7q36) and PTCH1(9q22)

與PTCH1類似，SMO也是Shh信號通路中的一個跨膜蛋白受體，SMO缺乏可能引起軟骨喪失和顱骨發育缺陷[23-24]。此前未見rs12674259的相關報道，它定位在內含子區，可能是轉錄因子結合位點，該位點的多態性可能導致轉錄因子結合位點的改變而影響基因轉錄。

此前有研究認為位于2號染色體上的基因GLI2與唇腭裂發生有關[15]，然而本次研究沒有發現二者的相關性，其中一個原因可能是樣本量不足，人群差異也可能導致研究結果不一致，此前還沒有在中國人群中的相關研究；另一個原因可能是SNP的選擇方法不一樣，我們希望用標簽SNP最大限度反映所有SNP，這種方法實用且經濟，但與傳統方法相比可能會丟失部分信息。本研究中用來檢測基因型的Sequenom質譜分析法是一種性價比較高的SNP檢測方法，適用于樣本量較大的病例對照研究，近年來越來越多的用于多基因疾病與SNP相關性的研究中[25-26]。

綜上，本研究強調了整個Shh信號通路與唇腭裂的相關性研究，分析關鍵基因對疾病的貢獻度和它們之間的關聯，發現了中國人群中PTCH1和SMO的兩個SNP位點與唇腭裂的關聯，表明Shh信號通路與唇腭裂的發生相關[27-29]，可以從新的角度幫助闡明唇腭裂發病機制，然而其具體作用機制目前還不清楚，需要未來設計實驗進一步探究。