利用轉錄組二代測序探索直腸癌術前放化療的敏感性分子特征

張 威，葉穎江，任仙文，黃 晶，申占龍△

(1. 北京大學人民醫院外科腫瘤研究室， 北京 100044； 2. 北京大學人民醫院胃腸外科， 北京 100044； 3. 北京大學生命科學學院生物動態光學成像中心， 北京 100871； 4. 北京大學基礎醫學院免疫學系， 北京 100191)

直腸癌術前新輔助放化療后病理緩解是預后良好的指標。美國國立綜合癌癥網絡(National Comprehensive Cancer Network, NCCN)發布的相關指南中推薦，對局部進展期中、低位直腸癌患者(臨床分期≥T3N+)行術前放化療。該推薦主要基于術前放化療可以有效控制直腸癌局部復發，其中18%～26%的患者放化療后標本無腫瘤細胞，即腫瘤病理完全緩解(pathologic complete response, pCR)[1]。腫瘤放化療反應的評估對于預測腫瘤治療的療效和制定進一步的治療計劃具有重要的意義。

目前臨床應用較多的病理評價標準是Dworak腫瘤消退分級(tumor regression grading，TRG)[2]，該分級主要通過組織病理標本中腫瘤細胞數量和組織纖維變性程度來判定，分為5級(TRG 4、3、2、1、0)。臨床研究中通常將TRG分級進行歸類，R?del等[3]把Dworak TRG的五個分級分為三個等級，即病理完全緩解(TRG4)、病理部分緩解(TRG2+TRG3)和病理緩解差(TRG0+TRG1)，發現在直腸癌接受術前放化療和根治性手術切除后，病理完全緩解組的5年無病生存率(disease free survival，DFS)為86%，病理部分緩解組為75%，病理緩解差組為63%(P=0.006)。Fokas等[4]的研究也得到類似結果，386例接受直腸癌放化療的患者中病理完全緩解組(TRG4)、病理部分緩解組(TRG2+TRG3)和病理緩解差組(TRG0+TRG1)的10年累計DFS分別為89.5%、73.6%和63.0%，組間差異有統計學意義(P=0.008)。

已有臨床試驗表明，術前放化療后臨床完全緩解(clinical complete remission，cCR)且未進一步行手術的患者，其結局與進一步接受手術的患者接近[5]。然而，在開始放化療前，國內外尚無一種令人滿意的方法能預測直腸癌患者放化療后的病理緩解情況，因此目前迫切需要一種手段，能夠將術前放化療后可能病理完全緩解、部分緩解和緩解差的直腸癌人群區分開，從而實現直腸癌精準分層的個體化治療。患者對治療的反應可能由遺傳基因決定，同一類疾病同一種治療方案可能因不同的基因特點產生不同的療效[6]，因此分子生物學有可能揭示直腸癌放化療敏感性的基因學基礎。

1 資料與方法

1.1 研究對象

前瞻性納入30例局部進展期中、低位直腸癌患者，術前放化療方案為常規長程同步放化療：45.0～50.4 Gy (1.8～2.0 Gy/次，5次/周，共25次)，同步5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)或卡培他濱化療，放化療后6～8周手術。30例患者均為2018年1—12月期間就診于北京大學人民醫院胃腸外科并經過術前新輔助治療和手術治療的直腸癌患者。本研究通過北京大學人民醫院醫學倫理委員會審核并獲得所有患者的知情同意。

1.2 研究方法

前瞻性收集臨床病理資料完整的30例局部進展期中、低位直腸癌患者并整理其相關資料，包括：一般情況(性別、年齡、體重指數)、放化療前影像學檢查資料[術前MRI T分期、N分期，壁外血管侵犯(extramural vascular invasion, EMVI)，腫瘤大小]、病理活組織檢查資料[腫瘤組織類型(腺癌、黏液腺癌、印戒細胞癌)、腫瘤分化程度(低分化、中分化、高分化)]等9項指標納入研究分析。

前瞻性留取30例患者新輔助治療前的腸鏡活檢病理樣本，-80 ℃保存備用。依據治療方案，30例患者均在放化療后6～8周接受手術治療，術后對患者進行病理TRG評估，根據放化療后的病理反應特點分為三組：病理完全緩解組(TRG4)、病理部分緩解組(TRG2+TRG3)和病理緩解差(TRG0+TRG1)組。對患者腫瘤組織進行轉錄組測序，整合測序數據進行系統生物信息學分析，注釋各組配對標本產生的突變數據，并分析轉錄組數據所提示的表達特征，從RNA水平定義與放化療反應相關的分子特征。

1.3 統計學分析

應用SPSS 20.0統計軟件進行分析，計數資料均采用Fisher’s確切概率檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 局部進展期中、低位直腸癌術后病理TRG分級及與臨床病理指標分析

前瞻性收集30例臨床病理資料完善的患者信息，由兩名病理科醫生對術后病理進行TRG分級評估，其中完全緩解9例、部分緩解12例、緩解差9例。TRG分級與患者臨床病理指標分析顯示，直腸癌放化療后病理TRG緩解程度與腫瘤術前MRI的T分期呈統計學負相關(P=0.046)，與術前MRI直腸癌EMVI呈統計學正相關(P=0.003，表1)。

2.2 轉錄組測序數據進行生物信息學分析

轉錄組測序獲得RNA-seq數據，平均每個樣本的測序深度達到3 000萬150 bp長的雙端測序讀段，分析獲得平均TPM (transcripts per million)≥100的轉錄本達863條，平均TPM≥10的轉錄本達8 898條，平均TPM≥1的轉錄本達47 040條。其中，與病理緩解程度相關的轉錄本P≤0.05的共有217條，P≤0.001的共有22條。對與術前放化療病理緩解相關的轉錄本表達情況進行分析，其中HSPA1A、HSPA1B和EXOSC2的高表達和術后病理緩解差呈顯著正相關(P<0.05)，而DNMBP、WASH8P、FAM57A和SGSM2的高表達和術后病理緩解良好呈顯著正相關(P<0.05，圖1)。

3 討論

3.1 直腸癌的臨床病理特點與治療結局密切相關

Williamson等[7]研究發現，直腸癌術前MRI中發現EMVI陽性的患者放化療后病理完全緩解率和預后明顯優于EMVI陰性的患者，而且CpG島高甲基化的患者EMVI的陽性率明顯較高。EMVI陽性即腸壁外的脈管受侵，腫瘤侵犯超過脈管系統固有層，是直腸癌的一種預后不良因素。EMVI通過引起血管纖維化對新輔助放化療起作用。Chand等[8]采用MRI檢測發現，新輔助放化療后EMVI纖維化顯著的患者無病生存期較好、腫瘤復發率較低，這可能是EMVI陽性患者放化療后病理完全緩解率和預后明顯優于EMVI陰性者的原因之一。Birlik等[9]發現，直腸癌放化療前MRI檢查，放化療病理緩解組的表觀擴散系數(apparent diffusion coeffecient，ADC)明顯低于未緩解組，術前MRI檢查的ADC值可能是預測直腸癌放化療效果的一項指標。McCawley等[10]的薈萃分析發現，1 724例接受術前放化療的直腸癌患者中，組織病理為黏液腺癌的患者放化療后病理完全緩解率(OR=0.078，P=0.002)和腫瘤降期率(OR=0.318，P<0.001)均明顯低于非黏液腺癌組。Agarwal等[11]的研究發現，直腸癌患者放化療前有淋巴管、血管侵犯與對放化療的反應顯著相關。Maas等[12]和Gérard等[13]則發現直腸癌患者放化療前的臨床T分期明顯影響放化療后腫瘤病理緩解度，T分期越早，放化療后病理緩解越好，同時Gérard等[13]的研究還發現，患者的性別、腫瘤大小也與放化療后腫瘤病理緩解相關。

表1 直腸癌術前放化療患者臨床病理資料與TRG分級的關系Table 1 Relationship between clinicopathological data and TRG classification in patients with colorectal cancer

BMI,body mass index; MRI, magnetic resonance imaging; EMVI, extramural vascular invasion.

CR, complete remission group; PR, partial remission group; NR, non-remission group; TPM, transcripts per million.圖1 與術前放化療病理緩解相關的轉錄本表達情況Figure 1 Transcript expression associated with pathologic remission of preoperative chemoradiotherapy

本研究通過對患者的臨床病理資料進行整理分析發現，直腸癌患者放化療前的臨床T分期越早，放化療后病理緩解越好，同時也發現直腸癌術前MRI顯示EMVI陽性的患者放化療后病理完全緩解率明顯優于EMVI陰性的患者。由此可見，我們不僅需要檢測與直腸癌放化療敏感性相關的分子，還要將患者的臨床病理特點整合在一起進行分析，這樣才能建立更有意義和更為完善的術前分子分型系統。

3.2 建立術前放化療敏感性分子特征分型系統具有指導意義

惡性腫瘤是一類分子水平上高度異質性的疾病，基于分子差異的個體化治療是腫瘤治療的方向。如果術前能通過檢測直腸癌患者組織標本的分子特點，即可獲知直腸癌患者對放化療是否敏感及敏感程度，從而個體化地為直腸癌患者選擇術前放化療及可能的放化療方案，最大程度地讓患者從術前放化療中獲益。目前已有學者發現一些基因突變或分子表達異常可能與直腸癌放化療敏感性相關，例如一項來自30個研究1 830例直腸癌的meta分析發現，p53基因野生型與直腸癌放化療后病理反應好明顯相關[14]；D’Angelo等[15]用microRNA基因芯片檢測發現，血漿中miR-125b在放化療抵抗的直腸癌患者中表達明顯升高，而miR-194在放化療敏感的患者中明顯升高；Agostini等[16]用含有45 868個探針的基因組芯片檢測19例術前放化療有效和23例無效的直腸癌患者，發現AGRN、HFM1、CSTF3、ZNF160等19個基因在兩組患者間的表達存在明顯差異；Scott等[17]則通過對13 638個樣本10個放療敏感性基因的表達檢測分析建立數學公式，發現基于基因組的放療劑量(genomic-based radiation dose，CARD)的值越大所需放療劑量越小、放療效果越好，認為基于基因檢測的CARD值可能個體化指導腫瘤的放療劑量，匹配個體化的腫瘤放射敏感性。既往這些研究多為基于芯片的基因表達研究或小樣本研究，因此尚不能全面反映腫瘤的分子特點(如基因突變拷貝數、融合基因等)。

本研究通過對直腸癌患者的轉錄組進行高通量測序、生物信息學分析，結合患者放化療后個體化的病理特點，發現HSPA1A、HSPA1B和EXOSC2高表達的患者術后病理緩解差，而DNMBP、WASH8P、FAM57A和SGSM2高表達的患者術后病理緩解良好，可見通過高通量測序、生物信息學分析可以更全面地探索直腸放化療敏感性分子的特征。

3.3 直腸癌放化療敏感性分子分型的建立為直腸癌放化療提供新靶點

5-FU化療藥聯合同步放療是目前直腸癌術前放化療的常規標準治療模式，有效率為70%左右。5-FU主要發揮放療增敏作用，放射增敏的生物學基礎主要是抑制了DNA復制和修復所必需的胸苷酸合成酶，5-FU與放療協同作用可導致細胞無法修復受損的DNA[18]。也有學者通過增加奧沙利鉑、伊立替康或分子靶向藥物等嘗試改善術前放化療效果，但存在一定爭議[19]。Aschele等[20]將700例患者隨機分入術前放療同時聯合5-FU及奧沙利鉑組或僅聯合5-FU組，發現兩組患者腫瘤的病理完全緩解率均為16%，差異無統計學意義(P=0.904)。

本研究對所獲取的P≤0.05的217條轉錄本進行信號通路富集初步分析后發現多條與抗原呈遞相關的細胞信號轉導通路，包括抗原處理與呈遞、對未折疊蛋白的響應、凋亡相關的核改變以及核酸相關的代謝過程，這些富集的細胞信號通路提示免疫細胞浸潤、細胞凋亡、蛋白質未折疊或不正確折疊等過程可能都與術前放化療和術后病理緩解存在聯系。本研究后續將基于研究獲得的直腸癌放化療敏感性分子特征，嘗試阻斷或增強與直腸癌放化療敏感性相關的分子通路，從而進一步探索能增加直腸癌放化療敏感性的候選新靶點。