熒光分析法測定人體血液樣品中脫嘌呤/脫嘧啶核酸內(nèi)切酶1(APE1)的活性

王嘉禹，趙美萍

(北京分子科學(xué)國家研究中心，生物有機與分子工程教育部重點實驗室，北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院，北京 100871)

人類脫嘌呤/脫嘧啶核酸內(nèi)切酶1(apurinic/apyrimidinic endonuclease 1，APE1)，又稱氧化還原因子-1(redox effector factor-1，Ref-1)，是人體內(nèi)的一種重要的DNA修復(fù)蛋白與基因調(diào)控蛋白。一方面，它作用于DNA雙鏈中的脫嘌呤/脫嘧啶位點(apurinic/apyrimidinic sites，簡稱脫堿基位點)，是人體內(nèi)最為重要的脫堿基核酸修復(fù)酶，在堿基切除修復(fù)途徑(base excision repair，BER)中發(fā)揮重要作用；另一方面，APE1還能通過其氧化還原功能調(diào)控多種轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合活性[1-2]。已有研究表明，人體血液及組織細(xì)胞中APE1含量的異常變化與多種疾病相關(guān)，血清中APE1可作為生物標(biāo)志物輔助肺癌、前列腺癌等疾病的臨床診斷。此外，細(xì)胞內(nèi)APE1的含量也會受活性氧等物質(zhì)的影響。細(xì)胞暴露實驗表明，大氣中的顆粒物會提高細(xì)胞中APE1 mRNA的表達(dá)水平[3]，但由于細(xì)胞中的mRNA表達(dá)水平并不與對應(yīng)蛋白的表達(dá)水平完全相關(guān)，若要說明細(xì)胞受到的氧化性損傷程度與APE1表達(dá)水平的關(guān)系，需要對細(xì)胞內(nèi)的APE1含量進行直接定量。另外，有研究表明APE1水平還與抗藥性相關(guān)，抑制APE1活性有助于提高細(xì)胞對藥物的敏感性[4]。因此，開發(fā)一種簡單而靈敏的檢測生物樣品中APE1活性的方法對于癌癥的診斷、預(yù)后監(jiān)測以及抗癌藥物篩選而言均具有重要的作用。

現(xiàn)有的APE1檢測方法主要有電化學(xué)分析法[5]、凝膠電泳法[6]、酶聯(lián)免疫吸附分析法[7]、液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)[8-9]與熒光探針法[10]等。其中，熒光探針檢測法相比于其他方法具有操作簡便、靈敏度高等優(yōu)點，能實現(xiàn)生物樣品中APE1含量的高通量檢測。本課題組Fang等[10]開發(fā)的APE1熒光探針對APE1具有良好的選擇性，不受生物樣品中其他核酸酶的干擾。但在檢測APE1含量非常低的血清樣品時，該方法的靈敏度不足(最低檢測限0.1 U/mL)，影響了定量的可靠性。在該方法基礎(chǔ)上，本研究改進了檢測反應(yīng)的條件，顯著提高了方法的靈敏度。新方法適用于不同來源、含量分布范圍寬的人血清樣品中APE1含量的定量檢測。此外，本研究還進一步建立了外周血單核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)蛋白提取液中APE1含量的測定方法，并對實際樣品進行了測定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.2 PBMCs的提取

以EDTA抗凝采血管采集全血樣品(0.5～1.5 mL)，加入等體積0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS，pH=7.4)稀釋后，用巴氏吸管吸取并小心加到人外周血淋巴細(xì)胞分離液中。室溫下，將混合溶液在水平轉(zhuǎn)子中離心，可看到有明顯的分層。用巴氏吸管小心吸取第一層與第三層之間的白膜細(xì)胞層至新離心管，并用0.01 mol/L PBS溶液洗滌得到的細(xì)胞。隨后將得到的細(xì)胞重懸于紅細(xì)胞裂解液(155 mmol/L氯化銨、10 mmol/L碳酸氫鉀、0.1 mmol/L EDTA)，至細(xì)胞團由粉紅色變?yōu)榘咨ｋx心除去上層溶液，用0.01 mol/L PBS溶液洗滌細(xì)胞兩次，可得PBMCs。

1.3 PBMCs蛋白質(zhì)提取

將PBMCs重懸于0.01 mol/L PBS溶液中，加入適量蛋白酶抑制劑復(fù)合物后在4 ℃孵育30 min，隨后將細(xì)胞懸液放在-75 ℃下凍存。將凍存的細(xì)胞在30 ℃水浴中解凍后，加入220 mmol/L氯化鉀，再在4 ℃孵育30 min，隨后在4 ℃下以13 000 r/min轉(zhuǎn)速離心15 min除去細(xì)胞碎片，得到的上層溶液即為PBMCs蛋白質(zhì)提取液。用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白提取液中蛋白質(zhì)的總濃度。

1.4 蛋白提取液及血清中APE1活性的測定

用0.04%(體積分?jǐn)?shù))Triton X-100 將APE1標(biāo)準(zhǔn)溶液(10 000 U/mL)稀釋至不同濃度。將APE1探針加入到組成為0.04% Triton X-100、50 mmol/L KAc、20 mmol/L Tris-Ac、10 mmol/L Mg(Ac)2、1 mmol/L 二硫蘇糖醇(dithiothreitol, DTT)的反應(yīng)緩沖液中，升溫退火后加入待測樣品(蛋白提取液或血清)或稀釋至不同濃度的APE1標(biāo)準(zhǔn)溶液，立即在37 ℃下對溶液進行實時熒光檢測。反應(yīng)液熒光強度隨時間變化曲線的斜率即為熒光強度上升速率，通過測定APE1標(biāo)準(zhǔn)溶液得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出原蛋白提取液中或血清中APE1的活性。檢測反應(yīng)均在200 μL PCR管中進行，反應(yīng)溶液總體積為50 μL，APE1探針終濃度為300 nmol/L，APE1標(biāo)準(zhǔn)溶液和待測樣品的加入體積為2～5 μL。實時熒光由Rotor-Gene Q實時熒光PCR儀進行檢測，熒光基團ROX的激發(fā)波長與發(fā)射波長分別為585 nm和610 nm，測定熒光的儀器通道為Orange通道，Gain值為10。

2 結(jié)果

2.1 檢測反應(yīng)液的優(yōu)化以及方法的靈敏度和線性范圍

目前最常用的兩種APE1反應(yīng)緩沖液分別是NEB緩沖液1.1(10 mmol/L Bis-Tris propane-HCl、10 mmol/L MgCl2、100 μg/mL牛血清蛋白)和NEB緩沖液4[50 mmol/L KAc、20 mmol/L Tris-Ac、10 mmol/L Mg(Ac)2、1 mmol/L DTT]。實驗發(fā)現(xiàn)在兩種緩沖液中，APE1熒光探針對APE1的響應(yīng)差別很大。在不額外加入其他輔助試劑的情況下，探針在NEB緩沖液1.1中對酶響應(yīng)的靈敏度和穩(wěn)定性都優(yōu)于在NEB緩沖液4中。我們曾選擇以NEB緩沖液1.1作為基礎(chǔ)，在其中額外加入3.5 mg/mL人血清蛋白，進一步改善了方法的靈敏度和抗干擾能力，可在實際血清樣品背景中定量測定APE1的活性[10]。但臨床樣品中APE1的濃度分布范圍很寬，有些接受過治療的患者血清中APE1的濃度會明顯下降，接近現(xiàn)有方法的最低檢測限(0.1 U/mL)，導(dǎo)致定量結(jié)果不可靠。

本研究嘗試以NEB緩沖液4作為基礎(chǔ)，探索進一步提高檢測靈敏度的反應(yīng)條件。通過多種對照實驗后發(fā)現(xiàn)，在NEB緩沖液4中額外加入0.04% Triton X-100，可使熒光信號顯著上升。由圖1A可見，在新反應(yīng)液中探針對APE1響應(yīng)的靈敏度甚至大大超過了之前在NEB緩沖液1.1加上3.5 mg/mL人血清白蛋白中反應(yīng)的方法。且在新的反應(yīng)液中，酶的穩(wěn)定性也進一步提高，對于準(zhǔn)確測定樣品中酶的活性十分有利。我們推測表面活性劑Triton X-100的加入不僅減少了操作過程中管壁對酶和探針可能存在的非特異性吸附作用，而且表面活性劑分子有可能結(jié)合到APE1分子的某些疏水性區(qū)域，導(dǎo)致酶的構(gòu)像發(fā)生變化，活性增強。另外，溶液中膠束的形成還有可能為APE1酶與DNA底物之間的反應(yīng)提供適宜的界面，從而使反應(yīng)速率顯著加快，具體機制目前還在進一步研究中。

圖1B和圖1C顯示了在新反應(yīng)液中不同濃度APE1與探針反應(yīng)的實時熒光曲線。圖1D為標(biāo)準(zhǔn)曲線，方法的線性范圍為0.01～2.0 U/mL，對APE1的檢測限降低到0.005 U/mL(3 pg/mL)，靈敏度比之前的方法提高了近20倍[10]。測得高濃度樣品的日間變異系數(shù)為1%，中等濃度樣品的日間變異系數(shù)為5%，所測最低濃度樣品(0.005 U/mL)的日間變異系數(shù)為8%(n=10)。因此，方法的功能靈敏度也為0.005 U/mL(3 pg/mL)。

圖1 A，在不同反應(yīng)緩沖液中APE1探針(200 nmol/L)對相同濃度APE1(2.0 U/mL)響應(yīng)的熒光曲線，其中NEB緩沖液4+0.04%Triton X-100為本研究新開發(fā)的反應(yīng)緩沖液；B，在新反應(yīng)液中APE1探針(300 nmol/L)與0.01～2.0 U/mL 范圍內(nèi)不同濃度APE1反應(yīng)的熒光曲線；C，在新反應(yīng)液中APE1探針(300 nmol/L)與0.005～0.1 U/mL范圍內(nèi)不同濃度APE1反應(yīng)的熒光曲線；D，在新反應(yīng)液中檢測APE1的線性范圍Figure 1 A, Fluorescence responses of the APE1 probe (200 nmol/L) to APE1 (2.0 U/mL) in different reaction buffers. NEB buffer 4+0.04% Triton X-100 is the new reaction buffer developed in this work; B, Fluorescence responses of the APE1 probe (300 nmol/L) to APE1 at different concentrations in the range from 0.01 to 2.0 U/mL in the new reaction buffer; C, Fluorescence responses of the APE1 probe (300 nmol/L) to APE1 at different concentrations in the range from 0.005 to 0.1 U/mL in the new reaction buffer; D, Linear working range of the APE1 probe in the new reaction buffer

2.2 人PBMCs蛋白質(zhì)提取液中APE1活性的檢測

在全血樣品稀釋液中加入人外周血淋巴細(xì)胞分離液后，通過密度梯度離心法分離了8份全血樣品中的PBMCs(圖2A)。按照前文所述步驟，用凍融法提取PBMCs中的蛋白質(zhì)，用APE1熒光探針測定了PBMCs蛋白質(zhì)提取液中APE1的含量，并用BCA蛋白定量試劑盒測定了8份蛋白提取液中的蛋白質(zhì)含量。根據(jù)蛋白提取液中的總蛋白質(zhì)濃度與APE1活性，所測8份PBMCs樣品中APE1的含量為0.11～0.72 U/μg 蛋白(0.061～0.40 ng/μg蛋白)，平均含量為0.30 U APE1/μg 蛋白(0.16 ng APE1/μg蛋白)。通過加標(biāo)回收實驗測得在PBMCs蛋白提取液中APE1的加標(biāo)回收率為98%±5%(n=3)。

2.3 人血清中APE1活性的檢測

血清中含有大量蛋白質(zhì)、多肽、脂質(zhì)等組分，血清背景對其中微量蛋白的定量測定常帶來嚴(yán)重干擾[11-12]。由于熒光探針靈敏度高，將血清樣品稀釋后進行測定，不僅可以減少血清需求量，而且有助于減小血清背景的干擾。為了確保稀釋后的血清中APE1的含量與原始樣品中APE1的含量有較好的線性相關(guān)性，我們選擇在探針反應(yīng)液中加入血清的量分別為5.0 μL、3.5 μL和2.0 μL，對應(yīng)血清稀釋倍數(shù)分別為10倍、14倍和25倍。將檢測結(jié)果換算回原始血清中APE1的含量，由圖2B可以看到，三種不同稀釋倍數(shù)下得到的結(jié)果基本一致，相差在5%以內(nèi)。由于將血清稀釋25倍后，部分血清的APE1活性會接近檢測限，不利于定量的準(zhǔn)確性，因此在實際測量過程中選擇將血清稀釋14倍進行檢測，這樣一方面保證了稀釋后的血清中APE1活性在方法的線性范圍之內(nèi)，另一方面也能相對減少血清的需求量。采用以上條件對102份正常人(男51例、女51例，年齡59～75歲)血清樣品中的APE1含量進行了檢測，得到這些血清樣品中APE1含量的分布范圍為0.13～0.34 ng/mL，加標(biāo)回收率為96%±15%(n=3)。

PBMC, peripheral blood mononuclear cells.圖2 A，密度梯度離心法分離人PBMCs；B，不同稀釋倍數(shù)測得原始血清中APE1的含量對照Figure 2 A, Isolation of PBMCs by density gradient centrifugation; B, Comparison of the APE1 concentration in human serum determined by different dilution folds

3 討論

APE1是人體中一種重要的多功能蛋白。首先，APE1在人體細(xì)胞中行使著超過95%的脫嘌呤/脫嘧啶核酸內(nèi)切酶活性，在堿基切除修復(fù)途徑中起著不可替代的作用[13]；其次，APE1作為氧化還原因子，對多種轉(zhuǎn)錄因子有重要的調(diào)控作用，影響多種基因的表達(dá)[14]；再次，APE1還能識別并切除多種DNA堿基損傷，在RNA代謝及miRNA的調(diào)控中扮演著重要的作用[2,15]。

有研究表明，APE1在多種癌細(xì)胞中出現(xiàn)表達(dá)異常的情況，包括定位和蛋白表達(dá)水平的變化[14]。例如在前列腺癌[16]和肺癌[17]等癌細(xì)胞中，APE1的表達(dá)水平與正常細(xì)胞相比有明顯的提高,而在卵巢上皮癌[18]等癌細(xì)胞中，APE1的分布與正常細(xì)胞相比有所不同。另外，血清中APE1的含量也會隨癌癥等疾病的發(fā)生和發(fā)展而變化，如非小細(xì)胞肺癌[7]和膀胱癌[19]等。因此，對生物樣品進行APE1含量的測定對于癌癥的診斷與治療效果的監(jiān)控等都具有非常重要的意義。

傳統(tǒng)的核酸酶檢測方法，如電化學(xué)分析法、凝膠電泳法等，往往需要較為繁瑣的操作步驟，檢測用時長，難以對生物樣品進行直接、快速的檢測。免疫分析法，如酶聯(lián)免疫吸附分析法等，利用了抗原與抗體的特異性結(jié)合作用實現(xiàn)對核酸酶的檢測，有著較高的靈敏度，但由于血清中APE1自身抗體的存在[20]，在檢測過程中會干擾APE1與外加標(biāo)記抗體間的結(jié)合，影響了結(jié)果的準(zhǔn)確性。近些年來，隨著液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的發(fā)展，已經(jīng)出現(xiàn)了利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測定生物樣品中APE1的方法[8-9]，但液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)需要非常復(fù)雜的樣品前處理過程，且現(xiàn)有的技術(shù)靈敏度仍不夠高，需要較大的樣品量，不利于大規(guī)模推廣到臨床檢測應(yīng)用。

與上述方法相比，熒光探針法具有操作簡便、耗時短、靈敏度高、樣品用量少等優(yōu)點。但是在檢測低濃度樣品時，目標(biāo)蛋白的穩(wěn)定性及在反應(yīng)管壁的非特異性吸附等都會給檢測結(jié)果帶來顯著的影響，這就要求進一步提高檢測方法的靈敏度和檢測過程中低濃度蛋白的穩(wěn)定性。在我們之前發(fā)展的熒光探針法的基礎(chǔ)上[10]，本研究進一步改進了反應(yīng)緩沖液的組成，顯著提高了APE1熒光探針對目標(biāo)酶響應(yīng)的靈敏度。改進后的熒光分析法最低檢測限達(dá)到3 pg/mL，比ELISA法(0.02 ng/mL[7])更為靈敏，且樣品消耗量更少，即使在檢測APE1含量較少的血清樣品時，也只需要約3.5 μL的血清樣品。此外，本文方法在檢測APE1時只需一步操作，相比于ELISA法耗時更短，利于實現(xiàn)大量生物樣品的檢測。與之前在反應(yīng)體系中加入高濃度人血清蛋白(3.5 mg/mL)的方法相比，本文的方法成本更低、穩(wěn)定性更好、使用也更加方便，在臨床檢驗和實驗室研究中都具有良好的應(yīng)用前景。