拉洛他賽的波譜解析及高效液相色譜法對其脂質體含量的測定

李雪琦，李建偉,2,3,4，李秋紅,4，閻 妍，段嘉倫，崔一諾，蘇展博，羅 倩，許佳瑞，杜亞菲，王桂玲，謝 英，呂萬良△

(1. 天然藥物與仿生藥物國家重點實驗室，分子藥劑學與新釋藥系統北京市重點實驗室，北京大學藥學院， 北京 100191； 2. 北京大學前沿交叉學科研究院， 北京 100871； 3. 山西振東制藥股份有限公司制劑所， 山西長治 047100； 4. 山西大學中醫藥現代研究中心， 太原 030006)

拉洛他賽(larotaxel, XRP9881, RPR109881)最初是由Sanofi-Aventis公司開發的通過半合成方法得到的一種新型的紫杉烷類細胞周期特異性化療藥，具有較廣的抑瘤譜。目前為止，該藥在國內外均未上市，我國山西振東藥業正在進行拉洛他賽脂質微球注射劑的新藥開發，并獲得了國家食品藥品監督管理局批準，目前正開展臨床試驗研究。

與其他紫杉烷類化療藥相似，拉洛他賽可作用于細胞分裂過程中紡錘體微管蛋白，與游離的微管蛋白結合，促進微管蛋白裝配成穩定微管并抑制微管解聚，從而抑制癌細胞的有絲分裂。初步研究顯示，拉洛他賽區別于其他紫杉烷類抗腫瘤藥，其可殺傷耐藥性癌細胞，還可透過血腦屏障，表現出很好的抗腫瘤應用前景[1-4]。體外研究表明，拉洛他賽的抗腫瘤活性強于紫杉醇，對多藥耐藥性腫瘤細胞展現出較強的抑制和殺傷作用[5-7]。現有的臨床研究結果表明，拉洛他賽作為二線治療或補救治療藥物，治療轉移性乳腺癌的療效優于多西他賽和多柔比星[8-10]。

有文獻報道顯示，國外用于臨床試驗的拉洛他賽制劑中，一般加入表面聚山梨酯作為增溶劑，以增加拉洛他賽的溶解度[11]，例如Sanofi-Aventis公司在用于二期臨床試驗的拉洛他賽注射劑中采用了聚山梨酯(吐溫-80)作為增溶劑。為避免采用表面活性劑可能導致的患者過敏，增強拉洛他賽對腫瘤組織的被動靶向性聚集，本課題組研究了一種拉洛他賽脂質體[12]。

為了對拉洛他賽及其脂質體制劑進行全面的定性和定量表征，本研究采用紅外吸收光譜、核磁共振波譜(nuclear magnetic resonance spectroscopy, NMR)、質譜和紫外光譜，對拉洛他賽的分子結構進行了光譜學解析，同時建立一種采用高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)對拉洛他賽進行含量測定的方法，為建立拉洛他賽制劑的質量標準提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

拉洛他賽(larotaxel)和拉洛他賽對照品(純度：99.8%)由山西振東制藥有限公司提供，氘代氯仿購自北京百靈威科技有限公司，甲醇(HPLC級)和乙腈(HPLC級)購自Burdick & Jackson公司(美國)，二棕櫚酰磷脂酰膽堿(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine，DPPC)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(distearoylphosphatidyl ethanolamine-polyethylene glycol, DSPE-PEG2000)購自Avanti公司(美國)，膽固醇購自北京市海淀區微生物培養基制品廠，其余試劑均為分析純，購自北京國藥試劑公司。

1.2 實驗儀器

BT-25S精密電子天平(十萬分之一)購自德國Sartorius公司，安捷倫1260型高效液相色譜儀購自Agilent公司(美國)，ZORBAX SB-C18反相色譜柱(Agilent, 5 μm, 4.6 mm×250 mm)購自Agilent公司(美國)，紅外光譜儀(Nexus 470)購自Nicolet公司(美國)，核磁共振波譜儀(Avance III 400)購自Bruker公司(德國)，高分辨質譜(Xevo G2 Q-TOF)購自Waters公司(英國)，紫外可見分光光度計(UV-1800型)購自上海美譜達儀器有限公司，RE52CS旋轉蒸發儀購自上海亞榮生化儀器廠，SB-5200超聲機購自寧波新芝生物科技股份有限公司，JY92-IID型超聲波細胞粉碎機購自寧波新芝生物科技股份有限公司，激光散射粒徑測定儀(Malvern zetasizer 3000HS)購自Malvern公司(英國)，透射電鏡(Tecnar G2 20ST型，TEM)購自FEI公司(美國)。

1.3 拉洛他賽的四大光譜測定

1.3.1質譜測定 采用單四級桿質譜儀(quadrupole mass spectrometer)，以甲醇作為液相基質對拉洛他賽進行檢測。

1.3.2紅外吸收光譜測定 采用KBr壓片法將拉洛他賽固體粉末進行壓片，然后檢測。分辨率為4.00，采樣增益為1.0，動鏡速度為0.474 7，光闌為100.00，檢測器為DTGS KBr，分束器為KBr，光源為紅外光源。

1.3.3核磁共振譜測定 將10.0 mg拉洛他賽溶于0.5 mL CDCl3，然后置于核磁管進行檢測，檢測溫度恒定為25 ℃。核磁共振譜包括：1H NMR,13C NMR,1H-1H COSY(1H-1H chemical-shift correlation spectroscopy), HSQC(heteronuclear single quantum correlation)，HMBC(heteronuclear multiple bond correlation)和DEPT(distortionless enhanced polarization transfer)135光譜。核磁化學位移為：CDCl3(TMS,1H NMRδ0.00,13C NMRδ0.0 ppm，ppm為百萬分之一相對化學位移)。

1.3.4紫外吸收光譜測定 取適量0.25 g/L的拉洛他賽標準溶液，在200～800 nm波長范圍內進行光譜掃描。

1.4 拉洛他賽高效液相色譜法的建立

1.4.1色譜條件 色譜柱為 SB-C18 柱(5 μm, 250 mm×4.6 mm)，測定溫度為25 ℃，流動相為乙腈-水(體積比為75 ∶25)，流速為1.0 mL/min，進樣量為10 μL，檢測波長為230 nm。

1.4.2標準曲線 精密稱取拉洛他賽對照品適量，加入甲醇溶解，制備200.0 mg/L的拉洛他賽貯備液，并倍比稀釋成0.5、1.5、3.0、6.0、12.0、25.0、50.0、100.0 mg/L系列濃度的拉洛他賽溶液樣品。按照上述色譜條件，取不同濃度的溶液分別進樣，用高效液相色譜儀檢測每一濃度的峰面積A值，并以濃度C為自變量，對相應的色譜峰面積A進行線性回歸，求得拉洛他賽的標準曲線。

1.4.3穩定性 精密稱取拉洛他賽對照品適量，加入甲醇溶解，制備成5.0、10.0和25.0 mg/L溶液，于制備后0、2、4、6、8 h分別用上述色譜條件測定峰面積，平行測定3次，取其平均值并計算相對標準偏差。

1.4.4回收率 取適量的空白脂質體，加入9倍體積的甲醇使脂質體破壞和溶解，加入精密稱定的拉洛他賽對照品溶液適量，以甲醇為溶劑，配制成 5.0、10.0和25.0 mg/L溶液各3份，分別用上述色譜條件測定峰面積，計算回收率和相對標準偏差。

1.4.5精密度 取適量的空白脂質體，加入9倍體積的甲醇使脂質體破壞和溶解，加入精密稱定的拉洛他賽對照品適量，以甲醇為溶劑，配制成5.0、10.0和25.0 mg/L拉洛他賽的系列濃度溶液，于5 d內分別用上述色譜條件測定峰面積，計算日內和日間相對標準偏差。

1.4.6檢測限 精密稱定的拉洛他賽對照品適量，加甲醇溶解并稀釋，按倍比配制系列濃度，分別按照上述色譜條件測定樣品的色譜峰，當信噪比約為3 ∶1時，其檢測濃度被認為是本方法的檢測限。

1.5 拉洛他賽脂質體的制備與表征

1.5.1拉洛他賽脂質體的制備 精密稱取DPPC、膽固醇、DSPE-PEG2000(60 ∶40 ∶5, μmol/μmol)和拉洛他賽(質量比為藥 ∶脂材=1 ∶20)置于茄形瓶中，加入適量氯仿 ∶甲醇(體積比為3 ∶1)溶液溶解，然后在40 ℃水浴減壓蒸發除去有機試劑，在瓶底和內壁形成一層均勻的脂膜。加入適量磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)水化，先在水浴中超聲2～3 min，形成乳白色均勻的粗脂質體，然后轉移到超聲波細胞粉碎機中進行探頭超聲，設置超聲工作時間為1 s，間歇時間為1 s，全程時間為10 min，保護溫度為35 ℃，功率為200 W。探頭超聲結束后，形成帶有弱藍色乳光的半透明液體，再將所得脂質體依次擠壓通過孔徑為400 nm、200 nm的聚碳酸酯膜，各擠壓過膜3次即得到拉洛他賽脂質體。

1.5.2空白脂質體的制備 與拉洛他賽脂質體的制備方法相同，但在成膜過程中不加入拉洛他賽。

1.5.3拉洛他賽脂質體的形態觀察 以去離子水作為分散介質，適當稀釋拉洛他賽脂質體，將稀釋后的拉洛他賽脂質體液再經200 nm的微孔濾膜過濾，然后將鋪有碳膜的銅網漂放在脂質體溶液上，1 min后取出用濾紙吸干，將俘獲有脂質體粒子的銅網漂放在1%(體積分數)醋酸雙氧鈾水溶液上，1 min后取出用濾紙吸干，靜置過夜，置于透射電鏡下觀察。

1.5.4拉洛他賽脂質體粒徑和Zeta電位的測定 取新制得的拉洛他賽脂質體各1 mL，加磷酸鹽緩沖溶液(pH 6.8)適當稀釋，利用激光散射粒徑測定儀測定。測定溫度設定為25 ℃，每個樣品測定20次，記錄其粒徑、多分散系數和Zeta電位值并計算平均值。

1.5.5拉洛他賽在脂質體中包封率的測定 取新制備的拉洛他賽脂質體500 μL，使之通過Sephadex G-50葡聚糖凝膠柱，以磷酸鹽緩沖溶液(pH 6.8)為流動相，分離未包封于脂質體的游離拉洛他賽，收集分離后的脂質體，加甲醇破壞，然后用高效液相色譜法進行測定。另外，取未過凝膠柱的拉洛他賽脂質體，適當稀釋后加入流動相破壞，然后用上述高效液相色譜法進行測定。拉洛他賽在脂質體中的包封率用以下公式計算：包封率=過凝膠柱脂質體中測得拉洛他賽量/未過凝膠柱脂質體中測得拉洛他賽量×100%。按照外標法，平行測定拉洛他賽對照溶液中的藥物量作為參比標準，計算拉洛他賽在脂質體中的包封率。

2 結果

2.1 拉洛他賽的質譜測定結果

拉洛他賽的正離子模式高分辨質譜見圖1A，結果顯示，測得m/z854.336 6為[M+Na]+(計算值為854.335 8)，m/z832.354 9為[M+H]+(計算值為832.408 0)。拉洛他賽的負離子模式高分辨質譜見圖1B，結果顯示，測得m/z876.345 4為[M+2Na-H]-(計算值為876.335 8)，m/z830.339 0為[M-H]-(計算值為830.408 0)。根據兩種模式下的質譜結果，可確定其分子式為C45H53NO14，其相對分子質量為831.900 1。

2.2 拉洛他賽的紅外吸收光譜測定結果

2.3 拉洛他賽的核磁共振光譜測定結果

拉洛他賽的核磁共振碳譜和氫譜分別見圖3A、3B。拉洛他賽的二維核磁共振譜分別見圖4A(1H-1H COSY)、4B(HSQC)、4C(HMBC)和4D(DEPT 135)。

拉洛他賽的一維核磁共振譜中共出現45個碳信號和53個質子信號，其中C-19為拉洛他賽的特征結構，其化學位移為15.63，所對應的兩個質子的化學位移分別為2.25 (1H, m)、1.66 (1H, t,J=5.8 Hz)。

拉洛他賽的二維核磁共振譜結果顯示，1H-1H COSY二維譜可以見到相耦合的質子相關信號，HSQC二維譜中可見到各個碳與相應質子的相關信號，HMBC二維譜中可見各個碳與相鄰質子的相關信號，DEPT 135二維譜所得碳的分類與結構式基本一致，共8個CH3、4個CH2、18個CH和15個季碳。

經1H-1H COSY、HSQC、HMBC和DEPT二維波譜驗證，1H NMR(400 MHz，CDCl3)和13C NMR(125 MHz，CDCl3)波譜提供的質子信號和碳信號全部進行歸屬[13]，詳細結果見表1，化學結構見圖5。

綜合上述一維及二維NMR譜所給出的信號，可以給全部碳、氫信號做出正確歸屬，證實拉洛他賽的化學結構式準確無誤，相應的，本研究所測定繪制的譜可望作為拉洛他賽參考標準核磁共振波譜。

A, positive ion mode; B, negative ion mode.圖1 拉洛他賽的高分辨飛行時間質譜圖Figure 1 Mass spectrums of larotaxel by quadrupole-time of flight mass spectrometry (Q-TOF-MS)

圖2 拉洛他賽的紅外吸收光譜Figure 2 Infra-red absorption spectrum of larotaxel

A, 13C NMR spectrum of larotaxel; B, 1H NMR spectrum of larotaxel. NMR, nuclear magnetic resonance; ppm, one millionth chemical shift.圖3 拉洛他賽的核磁共振碳譜及氫譜Figure 3 13C NMR and 1H NMR spectrums of larotaxel

2.4 拉洛他賽的紫外-可見吸收光譜掃描結果

當拉洛他賽甲醇溶液為0.25 g/L時，將該溶液在200～800 nm波長范圍內進行光譜掃描，得到拉洛他賽的紫外-可見吸收光譜圖(圖6)。根據其吸收光譜可知，拉洛他賽在203 nm處有最大吸收，在230 nm附近有較強的紫外吸收信號，但是250 nm處吸收信號很弱，在隨后波長的紫外和可見區拉洛他賽沒有吸收值。

2.5 拉洛他賽的高效液相色譜測定方法

2.5.1標準曲線 按照上述色譜條件，測定系列濃度的拉洛他賽溶液樣品的色譜峰面積A值，并以濃度C(mg/L)為自變量，對其相應的色譜峰面積A值進行線性回歸，求得標準曲線(圖7A)。拉洛他賽的標準曲線為A=11.82C+0.01，R2=0.999 9，具有很好的線性關系。拉洛他賽在此液相條件下的標準色譜圖見圖7B，拉洛他賽色譜峰的保留時間為5.71 min左右，峰型規整、對稱。

2.5.2穩定性 按照上述色譜條件，對濃度為 5.0、10.0和25.0 mg/L的拉洛他賽甲醇溶液分別在0、2、4、6、8 h時測定峰面積(表2)，結果表明，拉洛他賽在8 h內測定結果基本穩定，相對標準偏差(relative standard deviation，RSD)值小于2.0%。由此可知，拉洛他賽的甲醇溶液在8 h內具有較好的穩定性，進行含量測定時無需新鮮配制。

A,1H-1H chemical correlation NMR (1H-1H COSY) spectrum; B, 1H detected heteronuclear singular quantum correlation (HSQC) NMR spectrum; C, 1H detected heteronuclear multiple bond correlation (HMBC) NMR spectrum; D, distortionless enhanced polarization transfer (DEPT) 135 NMR spectrum. NMR, nuclear magnetic resonance; ppm, one millionth chemical shift.圖4 拉洛他賽的二維核磁共振譜Figure 4 2D-NMR spectrums of larotaxel

圖5 拉洛他賽的結構式和相對分子質量Figure 5 The structural formula and the relative molecular mass of larotaxel

圖6 拉洛他賽甲醇溶液(250 mg/L)在200～800 nm波長范圍內的紫外吸收掃描光譜Figure 6 Ultra-violet visible spectrophotometric scanning spectrum of larotaxel methanol solution (250 mg/L) in the range of 200-800 nm

表1 拉洛他賽的13C NMR和1H NMR波譜解析數據Table 1 1H NMR and 13C NMR assignments for larotaxel

s, singlet; d, doublet; t, triplet; m,multiplet; dt, double triplet; br.s, broad singlet; br.d, broad doublet. NMR, nuclear magnetic resonance.

Column: SB-C18 (5 μm, 250 mm×4.6 mm); mobile phase: acetonitrile-water (75 ∶25, volume/volume); detection wavelength: 230 nm. A, correlation profile between concentration and peak area values of larotaxel measured by HPLC-UV method; B, typical chromatogram of laro-taxel measured by HPLC-UV spectrum; C, chromatogram of limit of quantitation of larotaxel measured by HPLC. UV, ultraviolet; HPLC, high performance liquid chromatography.圖7 高效液相-紫外色譜法測定拉洛他賽的濃度與色譜峰面積相關曲線及典型色譜圖Figure 7 Correlation profile between concentration and peak area values of larotaxel measured by HPLC-UV method and typical chromatographs

2.5.3回收率 使用上述色譜條件對3份濃度分別為5.0、10.0和25.0 mg/L的拉洛他賽溶液進行測定(表3)，結果表明，拉洛他賽對照品的回收率為100%±2%，RSD值均小于1%，脂質體制劑中拉洛他賽的回收率為100%±3%，RSD值均小于2%。此含量測定方法對拉洛他賽對照品和脂質體制劑中的拉洛他賽均具有很好的準確性。

2.5.4精密度 使用上述色譜條件，于5 d內對5份濃度分別為5.0、10.0和25.0 mg/L溶液進行測定(表4)，數據顯示，拉洛他賽對照品的精密度為100%±5%，RSD值均小于2%，脂質體制劑中拉洛他賽的精密度為100%±5%，RSD值均小于2%。此含量測定方法對拉洛他賽對照品和脂質體制劑中的拉洛他賽含量測定均具有較好的精密度。

2.5.5檢測限 采用高效液相色譜法測量拉洛他賽的檢測限約為50.0 μg/L，在檢測限時的色譜圖見圖7C。

2.6 拉洛他賽脂質體的制備與表征結果

制備的拉洛他賽脂質體帶有微弱淡藍色乳光，其透射電鏡圖顯示，該脂質體呈圓球形的囊狀結構(圖8)。在該脂質體中，由于拉洛他賽是脂溶性藥物，與脂質體膜材一起溶解然后成膜，故拉洛他賽被包載于磷脂雙分子層中。

激光粒度儀分析結果顯示(表5)，拉洛他賽脂質體的平均粒徑為(105.73±2.30) nm，多分散系數為0.190±0.072，zeta電位為(0.240±0.015) mV。

高效液相色譜法測定該脂質體中拉洛他賽的包封率為87.73%±2.70%。

表2 拉洛他賽甲醇溶液HPLC-UV測定時的穩定性Table 2 HPLC-UV measurement stability of larotaxel in methanol

Data are presented as the mean±standard deviation (n=3). UV, ultraviolet; HPLC, high performance liquid chromatography; RSD, relative stan-dard deviation.

表3 拉洛他賽對照品及脂質體中用高效液相-紫外色譜法進行拉洛他賽含量測定的回收率Table 3 Recoveries of standard larotaxel and larotaxel in the liposomes measured by HPLC-UV

1, recoveries of standard larotaxel; 2, recoveries of larotaxel in the liposomes. Data are presented as the mean±standard deviation (n=3). Abbre-viations as in Table 2.

表4 拉洛他賽對照品及脂質體中用高效液相-紫外色譜法進行拉洛他賽含量測定的精密度Table 4 Precisions of standard larotaxel and larotaxel in the liposomes measured by HPLC-UV

1, recoveries of standard larotaxel; 2, recoveries of larotaxel in the liposomes. Data are presented as the mean±standard deviation (n=5). Abbre-viations as in Table 2.

表5 拉洛他賽脂質體的理化表征Table 5 Physicochemical characterization of larotaxel liposomes

Data are presented as the mean±standard deviation (n=3). PDI, polymer dispersity index.

3 討論

鑒于拉洛他賽在抗耐藥性和轉移性乳腺癌方面的藥效學優勢，目前國內外都在積極開展臨床試驗研究。本研究利用高分辨質譜、紅外吸收光譜、核磁共振譜和紫外-可見光吸收光譜對拉洛他賽分子式、相對分子質量及化學結構進行了確證與解析，提供的四大光譜圖可作為拉洛他賽的參考標準圖譜，用作其藥物研究、藥品鑒定、藥品開發檢驗和生產質量控制等。

在正離子模式下的高分辨質譜圖中，拉洛他賽呈現兩個強信號峰，分別為m/z854.336 6和m/z832.354 9，分別對應[M+Na]+和[M+H]+；在負離子模式下的高分辨質譜圖中，拉洛他賽呈現兩個強信號峰，分別為m/z876.345 4和m/z830.339 0，對應[M+2Na-H]-和[M-H]-。兩種模式下的質譜結果，驗證了拉洛他賽的分子式為C45H53NO14，相對分子質量為831.900 1。

圖8 拉洛他賽脂質體的透射電鏡圖像Figure 8 Transmission electron microscope (TEM) image of larotaxel liposomes

在拉洛他賽的紅外吸收光譜中，化學結構中的苯環、酯基、羥基、叔丁基和酰胺結構等關鍵官能團均有相應吸收峰，因此進一步驗證了其分子結構上的特征吸收峰，且吸收峰強度適宜、無雜峰，可以作為拉洛他賽的紅外吸收光譜標準對照圖譜，用于該藥品的定性與鑒定。

拉洛他賽的核磁共振譜中的碳信號和質子信號較全面，信號強度適當并且幾乎無雜質峰信號，在二維核磁共振譜的指導下，1H和13C信號均能得到合理歸屬，因此，呈現的核磁共振碳譜和氫譜均可作為拉洛他賽的標準核磁共振譜，用于其藥品鑒定和純度檢測。

在拉洛他賽的紫外-可見光吸收光譜中，拉洛他賽在203 nm處有最強吸收，但是在該波長處紫外測定具有較強的溶劑干擾效應，且在其他波段無明顯吸收，故采用常用的紫外-可見分光光度法無法對拉洛他賽進行定量測定。雖然如此，拉洛他賽在230 nm處有較強的紫外吸收，故230 nm可用作高效液相-紫外色譜檢測的波長。

為此，我們進一步建立了高效液相-紫外色譜法，旨在建立拉洛他賽的定量測定方法。經方法有效性驗證顯示，該方法靈敏、高效，具有很好的線性關系，且回收率和精密度高，具備良好的穩定性和準確性，可用于拉洛他賽原料藥和脂質體制劑中拉洛他賽的含量測定。

此外，本研究制備的拉洛他賽脂質體稍呈正電性、形態規整、粒徑適當、大小分布均一、載藥包封率高。初步觀察顯示，該脂質體不易發生聚沉，其脂質體膜上用含PEG的磷脂材料修飾，預期也可以增加給藥后在血液系統中的穩定性，延長體內循環時間，減少網狀內皮系統快速清除與代謝，從而增加拉洛他賽脂質體在腫瘤組織中的富集和滯留，有利于提高藥效并降低全身副作用[14-16]。

綜上所述，本研究對拉洛他賽進行了詳細的高分辨質譜、紅外吸收光譜、核磁共振譜和紫外-可見光譜測定，進行了波譜解析并制定了相應的參考標準圖譜，驗證并確認了拉洛他賽的分子式、相對分子質量和結構式，建立了拉洛他賽的高效液相-紫外色譜含量測定方法，可用于新藥拉洛他賽脂質體的質量控制。