IgA腎病易感基因遺傳多態性的種族差異分析

康玉琦，張月苗，侯 平，師素芳，劉立軍，周緒杰，呂繼成，張 宏

(1.北京大學第一醫院腎內科，北京 100034； 2. 廣州中醫藥大學第四臨床醫學院腎病科，深圳 518033)

IgA腎病(IgA nephropathy，IgAN)是全球最常見的原發性腎小球腎炎，患者在10～20年內將有5%～30%進展至終末期腎臟病。IgAN發病的家庭聚集現象和不同種族人群之間發病率差異提示遺傳因素參與了IgAN的發病[1-3]。全基因組關聯研究(Genome Wide Association Study，GWAS)發現多個IgAN相關的遺傳座位，包括抗原提呈[主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex，MHC)]、補體系統[補體因子H相關蛋白1/3(complement factor H-related protein 1/3，CFHR1/3)和整合素αM/αX(integrin αM/αX，ITGAM-ITGAX)]、調控IgA產生[腫瘤壞死因子配體超家族成員13(tumor necrosis factor ligand superfamily member 13，TNFSF13)和白血病抑制因子/抑瘤素M(leukemia inhibitory factor/oncostatin，LIF/OSM]、固有免疫[α防御素(α-defensin，DEFA)、胱天蛋白酶富集域家族成員9(caspase recruitment domain family member 9，CARD9)、ITGAM-ITGAX和鳥嘌呤核苷酸交換因子3(vav guanine nucleotide exchange factor 3，VAV3)][4-8]，為探討疾病致病通路提供了重要線索。然而，與歐洲人群相比，亞洲人群的IgAN患病率明顯升高[3]，提示IgAN患者在不同人群之間存在遺傳異質性。在其他多基因遺傳的復雜性疾病中，如系統性紅斑狼瘡多種族人群研究發現中國人群與歐洲人群之間遺傳位點相似，但是中國人群具有更高的疾病遺傳風險[9]。本研究擬通過檢索歐洲人群中報道的IgAN易感基因遺傳多態性，在中國人群中進行驗證，并進一步比較中國人群與歐洲人群之間的遺傳差異，旨在探討IgAN不同種族人群發病率和表型差異的遺傳基礎。

1 資料與方法

1.1 研究對象

研究對象包括來自北京大學第一醫院腎內科IgAN數據庫中前期GWAS研究人群[5]、1000 Genome 3期人群中504名東亞人群和503名歐洲人群。

IgAN的GWAS研究人群為來自北方漢族的1 194 名IgAN患者[平均年齡(31.1±10.7)歲，男性百分比54%]和902名健康對照[平均年齡(31.5±8.4)歲，男性百分比67%]。IgAN患者納入標準為：符合腎穿刺活檢病理診斷，光鏡下腎小球系膜細胞和系膜基質增生，免疫熒光下以IgA為主的免疫復合物顆粒樣沉積于系膜區，并且至少在 2+以上，電子顯微鏡下系膜區有電子致密物沉積；排除標準為：通過臨床表現以及實驗室檢查證實為其他系統疾病導致的繼發性IgAN，包括慢性乙型肝炎、肝硬化、過敏性紫癜、系統性紅斑狼瘡等疾病。健康對照為尿液檢查正常，且除外合并腎臟病及其他系統性疾病。收集IgAN患者腎穿刺活檢時完整的基線臨床病理資料，包括腎小球濾過率(estimated glomerular filtration rate，eGFR)、血肌酐、24小時尿蛋白定量、血漿IgA、血漿IgA1、血壓、尿酸、血脂、Haas分級等信息。患者eGFR由EPI公式計算所得。IgAN數據庫資料的使用獲得北京大學第一醫院生物醫學研究倫理委員會批準，所有受試者均簽署知情同意。

1.2 單核苷酸多態性選擇和基因分型

通過檢索GWAS數據庫(GWAS Catalog)和文獻，目前3/5個IgAN的GWAS包含歐洲人群[4-5,7]。選取歐洲人群中與IgAN易感性相關的獨立單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNP)位點作為候選基因位點。

候選遺傳多態性位點在IgAN研究人群中的基因分型從前期發表的GWAS數據中獲取[5]。GWAS數據采用Illumina Human 610-Quad BeadChip進行基因分型，樣本質控去除基因型分型成功率<95%、性別不一致、存在潛在親緣關系或重復樣本個體，位點質控去除基因型分型成功率<95%、次等位基因型頻率<1%、不符合Hard-Weinberg平衡(P<1×10-4)、重復值的位點，人群分層采用主成分分析進行控制。質控后剩余1 194名IgAN患者和902名健康對照，498 329個SNP位點。對于原始GWAS數據中沒有基因分型信息的SNP位點，通過對GWAS數據進行基因型填補(imputation)獲取遺傳關聯信息。具體步驟如下：(1)從芯片數據中截取目標基因及其上、下游區段，整理成 PLINK 對應的二進制文件格式，利用UCSC 網站 LiftOver(http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgLiftOver)在線平臺將各芯片中SNP對應的物理位置轉化為b37版本；(2)等位基因一致性檢查：DNA 有正義和反義兩條互補鏈，為了解決樣本SNP 所在 DNA 鏈與模板數據庫中DNA 所在鏈存在潛在不一致性的問題，將芯片分型數據統一對齊到正義鏈上；(3)單倍型估算：采用軟件SHAPEIT2對1000 Genome亞洲人群對應目標基因片段分型數據進行單倍型估計；(4)基因型填補：IMPUTE2軟件進行基因型填補；(5)基因型填補后按上述標準對樣本和位點進行質控后，采用SNPTEST軟件進行關聯分析。

候選遺傳多態性位點在1000 Genome 3期東亞人群和歐洲人群中的基因分型信息通過enseble數據庫獲取(http://asia.ensembl.org/index.html)。

1.3 遺傳危險度指標選擇

1.4 統計方法

GWAS數據采用PLINK軟件(http://www.cog-genomics.org/plink2)進行基因型關聯分析。GWAS數據Imputation采用IMPUTE2軟件(http://mathgen.stats.ox.ac.uk/impute/impute_v2.html)進行，參考人群選用1000 Genome 3期人群中的亞洲人群，基因型關聯分析采用SNPTEST軟件(http://mathgen.stats.ox.ac.uk/genetics_software/snptest/snptest.html)進行。

組間統計分析采用SPSS 16.0軟件進行，符合正態分布的計量資料組間比較采用配對t檢驗、獨立樣本t檢驗、方差分析和線性回歸模型；非正態分布的計量資料組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗和Kruskal-WallisH檢驗；計數資料采用卡方檢驗和Logistics回歸分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 中國IgAN患者易感SNP位點與歐洲人群相似

本研究中1 194例IgAN患者基線臨床和病理資料結果見表1。目前，共有11個基因座位上的16個獨立SNP位點與歐洲人群IgAN患者易感性顯著相關，其中8個SNP位點位于人類白細胞抗原基因(human leukocyte antigen，HLA)域，包括VAV3(rs17019602)、CFHR3，1-del(rs3766404和rs6677604)、HLA(rs3115573、rs7763262、rs9275224、rs2856717、rs9275596、rs9357155、rs1883414和rs3129269)、DEFA(rs10086568)、CARD9(rs4077515)、ITGAM-ITGAX(rs11150612)、TNFSF13(rs3803800)和HORMAD2(rs2412971)。其中，15個SNP位點在本研究中國人群中有基因分型數據，1個SNP位點rs10086568的基因型數據通過Imputation獲得。上述16個SNP位點在本研究中國人群中均符合Hard-Weinberg平衡，結果顯示93.75%(15/16)的SNP位點與中國人群IgAN遺傳易感性顯著相關(P<0.05)，且與歐洲人群具有相同的危險等位基因型。但相關SNP位點危險等位基因型頻率和效應值在中國人群和歐洲人群存在差異，特別是rs11150612A危險等位基因歐洲人群次等位基因型(0.36)是中國人群的主要等位基因型(0.75)(表2)。

2.2 中國人群較歐洲人群危險等位基因型頻率、危險等位基因OR值及人群歸因風險百分比更大

進一步分析與中國人群和歐洲人群IgAN易感性均顯著相關的15個SNP的危險等位基因型頻率和效應值的種族間差異發現，中國人群中危險等位基因型頻率更高(P=3.09×10-2),危險等位基因型OR值更大(P=1.94×10-2),疾病歸因風險百分比更高(P=3.03×10-4)(圖1)。

2.3 IgAN患者遺傳危險度評分與血漿IgA1水平、慢性腎臟病分期和Haas分級相關

利用顯著相關的SNP位點計算GRS，發現IgAN患者uwGRS和wGRS均比健康對照顯著升高(P分別為1.40×10-28和3.60×10-27，圖2)。進一步將相關SNP位點按其是否位于HLA區域組計算GRS，比較IgAN患者各GRS評分(非HLA-uwGRS、非HLA-wGRS、HLA-uwGRS、HLA-wGRS、uwGRS和wGRS)與臨床病理表型的相關性。結果如表3所示，GRS與IgA1水平顯著正相關，主要體現在非HLA區域SNP位點；GRS與慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)分期和Hass分級顯著相關，提示遺傳因素參與病理損傷和腎功能進展。

表1 1 194例IgAN患者的基線臨床資料Table 1 Baseline clinical manifestations of 1 194 IgA nephrpathy patients

IQR,interquartile range; eGFR, estimated glomerular filtration rate.

OR, odds ratio; PARP, population attributable risk proportion; RAF, risk allele frequency.圖1 IgAN易感基因遺傳性位點在中國人群和歐洲人群的疾病風險比較Figure 1 Comparison of OR, PARP and RAF between the Chinese and Europeans

2.4 亞洲人群較歐洲人群遺傳危險度評分更高

利用1000 Genome 3期人群數據計算東亞人群和歐洲人群GRS進行種族間比較發現，與IgAN患者患病率流行病學趨勢相一致，東亞人群uwGRS和wGRS均顯著高于歐洲人群(P值分別為3.63×10-38和1.78×10-163,圖3)，而東亞人群和歐洲人群各亞群之間差異未顯示出統計學意義(P> 0.05，圖4、5)。

uwGRS, unweighted genetic risk score; wGRS, weighted genetic risk score; IgAN, IgA nephropathy.圖2 IgAN患者和健康對照遺傳危險度評分比較Figure 2 Comparison of genetic risk score between the IgAN patients and controls

uwGRS, unweighted genetic risk score; wGRS, weighted genetic risk score.圖3 東亞人群和歐洲人群IgAN遺傳危險度評分比較Figure 3 Comparison of genetic risk score between East Asians and Europeans

uwGRS, unweighted genetic risk score; wGRS, weighted genetic risk score; CDX, Chinese Dai in Xishuangbanna; CHB, Chinese Han in Beijing; CHS, Southern Han Chinese; JPT, Japanese in Tokyo; KHT, Kinh in Ho Chi Minh City.圖4 東亞人群之間IgAN遺傳危險度評分比較Figure 4 Comparison of genetic risk score among subpopulations in East Asians

uwGRS, unweighted genetic risk score; wGRS, weighted genetic risk score; CEU, Utah residents with Northern and Western European Ancestry; FIN, Finnish in Finland; GBR, British in England and Scotland; IBS, Iberian population in Spain; TSI, Toscani in Italia.圖5 歐洲人群之間IgAN遺傳危險度評分比較Figure 5 Comparison of genetic risk score among subpopulations in Europeans

3 討論

IgAN為全球范圍內最常見的原發性腎小球腎炎，是我國尿毒癥的主要病因。約80%的IgAN患者在20～30歲時發病，并且病情呈慢性進展，臨床很難治愈。約1/3的患者在發病10年后進展到終末期腎臟病——尿毒癥，只能依賴透析或腎移植維持生命，使得這群本應是社會勞動力核心的患者長期勞動力減弱或喪失，社會和家庭經濟負擔沉重[13-14]。IgAN的家族聚集現象和不同種族人群之間的發病率差異表明，遺傳因素參與了IgAN的發病[1-3]。隨著高通量基因分型技術的出現，基于大樣本散發性人群進行的GWAS發現了多個IgAN的易感基因，包括適應性免疫反應(MHC)、補體系統(CFH、CFHR3,1和ITGAM-ITGAX)、IgA分子產生調控(TNFSF13、HORMAD2和ST6GAL1)和黏膜免疫(DEFA、CARD9、VAV3、ODF1-KLF10和UBR5)。據估算，IgAN的遺傳度為50%～70%，目前發現的易感位點對IgAN遺傳變異的解釋度尚不足10%，提示仍有大量遺傳因素未被發現。隨著GWAS的開展，雖然擴大樣本量將有助于進一步發現易感基因，但是單純追求樣本量的擴大越來越難，特別是對于IgAN這類人群發病率較低的疾病。多基因遺傳復雜性疾病GWAS新近遺傳學研究的一個關鍵發現是，大量遺傳變異在不同種族人群中存在共性遺傳位點，并且遺傳危險評分與疾病流行病學發病率相一致。整合不同種族人群之間的遺傳學研究為揭示發現疾病新的易感基因、揭示疾病發病機制之間的種族差異提供了重要線索[15-17]。然而，目前尚缺乏有關IgAN遺傳學種族間差異的相關研究。

本研究基于已發現歐洲人群IgAN易感性相關位點，結合中國人群遺傳信息探究了IgAN的種族間遺傳差異。結果發現，在中國人群和歐洲人群，絕大部分(93.75%，15/16)遺傳多態性位點的顯著性和危險等位基因相一致，提示不同種族人群之間存在共同的遺傳基礎。通過Meta分析等研究策略，整合IgAN研究領域不同種族人群數據有望發現新的疾病易感基因。進一步比較發現，中國人群與歐洲人群相比，危險等位基因型頻率、OR值和人群歸因風險百分比均顯著升高。IgAN患者與健康對照以及東亞人群與歐洲人群相比，GRS顯著升高，并且與IgAN患者血漿IgA1水平、CKD分期和Hass分級顯著正相關。IgA分子為IgAN發病機制研究中的核心分子[18-19]，既往大量遺傳學研究發現了多個與IgAN發病相關的易感基因，并從功能和表型上得以驗證，提出遺傳多態性影響IgA1分子糖基化，通過啟動異常補體激活參與IgAN發生和發展的遺傳發病機制假說[20-22]。本研究顯示，遺傳危險度評分與血IgA1分子水平、病理損傷程度和腎功能分期相關，為中國人更高的發病風險和更高的發病率提供了遺傳學線索。

綜上所述，本研究基于目前IgAN的遺傳學發現，系統評價了遺傳多態性位點在中國人群和歐洲人群之間的差異。不同種族人群之間存在共同的遺傳基礎，Meta分析利于擴大樣本發現新的易感基因。此外，與歐洲人群相比，亞洲人群具有更高的遺傳風險，為IgAN不同種族間發病率差異提供了來自遺傳學層面的線索。后續將進一步在全基因組范圍內整合和探究不同種族人群之間的遺傳特點和差異。