肝細胞癌中趨化因子CXCL10及其受體CXCR3的表達及臨床意義分析

張 婧，陳 潔，關(guān)貴文，張 婷，魯鳳民，陳香梅

(北京大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系暨北京大學(xué)感染病研究中心，北京 100191)

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，其術(shù)后5年腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高達40%～70%[1]。HCC的致病因素主要包括慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染、慢性丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染、食物黃曲霉毒素暴露、嗜酒以及非酒精性脂肪肝等[2]。我國的HCC發(fā)生多與慢性HBV感染有關(guān)，且大約70%～90%的乙肝相關(guān)HCC都有肝硬化背景[3]，因此，闡明HCC特別是乙肝相關(guān)HCC的致病機制將對我國HCC防治具有重要意義。

趨化因子及其受體在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，趨化因子CXCL10是由干擾素-γ(interferon-γ, IFN-γ)誘導(dǎo)產(chǎn)生的一類趨化因子,CXCR3是CXCL10基因的唯一受體。近年的研究顯示，CXCL10/CXCR3信號通路與炎癥和腫瘤發(fā)生密切相關(guān)[4]。本研究通過對癌癥基因組圖譜(the cancer genome atlas，TCGA)和來自國際肝癌研究所(Liver Cancer Institute，LCI)數(shù)據(jù)庫的HCC表達數(shù)據(jù)庫挖掘，以及采用實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)方法檢測45例乙肝相關(guān)HCC組織中CXCL10基因和CXCR3基因剪接異構(gòu)體B(CXCR3B)的表達，分析CXCL10和CXCR3基因的異常表達與HCC患者預(yù)后的相關(guān)性，探索CXCL10基因和CXCR3基因在HCC發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床標(biāo)本

45例原發(fā)性HCC患者的癌組織和配對癌旁組織樣本取自鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院接受肝癌手術(shù)切除的患者，HCC診斷標(biāo)準(zhǔn)參照中國2011年《原發(fā)性肝細胞癌診療規(guī)范》[5]。所有HCC患者均為男性，均有慢性HBV感染及肝硬化背景，并經(jīng)病理學(xué)確診。8例正常肝組織來源于肝血管瘤患者。本研究已獲得北京大學(xué)生物醫(yī)學(xué)倫理委員會審批(IRB00001052-12088)， 所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 TCGA和LCI數(shù)據(jù)庫分析

TCGA肝細胞癌基因表達數(shù)據(jù)下載自美國Broad 研究所基因數(shù)據(jù)分析中心(http://gdac.broadinstitute.org/)，采用FPKM(fragments per kilobase million)法對TCGA轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)進行標(biāo)準(zhǔn)化，并去除了部分重復(fù)檢測的病例，最終納入370例不同病因的HCC組織及50例癌旁組織的數(shù)據(jù)。

LCI肝細胞癌基因表達數(shù)據(jù)下載自高通量功能基因組數(shù)據(jù)GSE14520(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)，最終納入204例有隨訪信息的HCC患者，所有患者均有HBV感染背景。

1.3 主要試劑及儀器

RNA提取試劑Trizol購自美國Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自立陶宛Fermentas公司，實時熒光定量PCR試劑購自美國Super Array Biosciences公司，實時熒光定量PCR儀購自瑞士Roche 公司(Light Cycler 480Ⅱ)。

1.4 組織RNA提取

將約100 mg的HCC、癌旁或正常肝組織分別置于裝有液氮的研缽中，充分研磨至細粉狀，移至無RNA酶的1.5 mL EP管中。加入1 mL Trizol試劑，按照說明書提取肝組織的總RNA。用NanoDrop2000測定RNA濃度，分裝凍存于-80 ℃冰箱中備用。

1.5 逆轉(zhuǎn)錄和qPCR實驗

按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，在20 μL的反應(yīng)體系內(nèi)，以5 μg總RNA為模板，用隨機引物合成cDNA鏈。取1 μL逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用于qPCR實驗，PCR擴增條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。PCR反應(yīng)運行結(jié)束后，采用Roche軟件分析每孔反應(yīng)的Ct值，以管家基因C-TBP1的表達為內(nèi)參照，計算CXCL10基因和CXCR3B基因的相對表達量，qPCR引物見表1。

表1 臨床標(biāo)本qPCR引物Table 1 qPCR primer sequences for clinical samples

F, forward primer; R, reverse primer.

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS 22.0及GraphPad Prism 5軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。正態(tài)計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差進行描述，其中配對資料用配對t檢驗，非配對資料用非配對t檢驗，相關(guān)性分析用Pearson相關(guān)；非正態(tài)資料采用中位數(shù)和上下四分位數(shù)[M(P25，P75)]描述，其中配對資料用Wilcoxon配對檢驗，非配對資料比較用Mann-WhitneyU檢驗，相關(guān)性分析用Spearman 秩相關(guān)。使用Kaplan-Meier法進行生存分析，Log-rank檢驗用于比較組間生存差異。r≥0.3即認為具有相關(guān)性，多重比較時采用Bonferroni法對P值進行校正，P<0.05即認為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TCGA數(shù)據(jù)庫中CXCL10和CXCR3基因在HCC樣本中的表達及預(yù)后

為探索CXCL10及其受體CXCR3基因在HCC組織中的表達情況，我們首先分析TCGA數(shù)據(jù)庫中370例HCC組織和50例癌旁組織中的基因表達，結(jié)果顯示HCC組織中的CXCL10基因表達水平顯著高于癌旁組織(P<0.001，圖1A)。在TCGA數(shù)據(jù)庫中，有50例HCC患者同時有HCC和配對癌旁組織的表達數(shù)據(jù)，分析CXCL10基因在配對HCC及癌旁組織中的表達，結(jié)果顯示50例HCC組織中CXCL10基因的表達水平顯著高于配對癌旁組織(P=0.018，圖1B)。進一步采用Kaplan-Meier法分析了CXCL10基因表達水平與HCC患者預(yù)后的相關(guān)性，結(jié)果顯示與CXCL10基因低表達(n=185)的HCC患者相比，CXCL10基因高表達(n=185)的HCC患者5年總體生存率升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.107，圖1C)。

我們采用同樣的方法也分析了TCGA數(shù)據(jù)庫HCC組織中CXCR3基因的表達，結(jié)果表明370例HCC組織中CXCR3基因表達水平顯著高于50例癌旁組織(P<0.001，圖1D)，且CXCR3基因在50例配對HCC組織中的表達亦顯著高于癌旁組織(P=0.037，圖1E)。Kaplan-Meier分析結(jié)果表明CXCR3基因高表達(n=185)的HCC患者5年總體生存率顯著高于CXCR3基因低表達(n=185)的HCC患者(P=0.004，圖1F)。

A, the expression of CXCL10 in nonpaired HCC tumor tissues (n=370) and non-tumor tissues (n=50); B, the expression of CXCL10 in paired HCC tumor tissues and non-tumor tissues (n=50); C, the prognostic of CXCL10 in HCC patients; D, the expression of CXCR3 in nonpaired HCC tumor tissues (n=370) and non-tumor tissues (n=50); E, the expression of CXCR3 in paired HCC tumor tissues and non-tumor tissues (n=50); F, the prognostic of CXCR3 in HCC patients. Results were showed as 圖1 TCGA數(shù)據(jù)庫HCC與癌旁組織中CXCL10基因和CXCR3基因的表達及預(yù)后分析Figure 1 Expression and prognostic of CXCL10 and CXCR3 in HCC tumor tissues and non-tumor tissues in TCGA database

2.2 LCI數(shù)據(jù)庫中CXCL10和CXCR3基因在HCC樣本中的表達及預(yù)后

我們進一步分析了LCI數(shù)據(jù)庫中CXCL10基因和CXCR3基因在乙肝相關(guān)HCC樣本中的表達情況，結(jié)果表明HCC組織中CXCL10基因表達水平顯著高于癌旁組織(P=0.009，圖2A)。Kaplan-Meier分析結(jié)果顯示，CXCL10基因高表達(n=102)HCC患者的5年總體生存率顯著高于CXCL10基因低表達(n=102)HCC患者(P=0.002，圖2B)，但CXCR3基因在HCC組織中的表達顯著低于癌旁組織(P=0.003，圖2C)。Kaplan-Meier分析結(jié)果所示，CXCR3基因高表達(n=102)HCC患者的5年總生存率高于CXCR3基因低表達(n=102)HCC患者(P=0.014，圖2D)。

A, the expression of CXCL10 in HCC tumor tissues and non-tumor tissues (n=204); B, the prognostic of CXCL10 in HCC patients (n=204); C, the expression of CXCR3 in HCC tumor tissues and non-tumor tissues (n=204); D, the prognostic of CXCR3 in HCC patients (n=204). Results were showed as 圖2 LCI數(shù)據(jù)庫HCC與癌旁組織中CXCL10基因和CXCR3基因的表達及預(yù)后分析Figure 2 The expression and prognostic of CXCL10 and CXCR3 in HCC tumor tissues and non-tumor tissues in LCI database

2.3 qPCR方法檢測HCC樣本中CXCL10和CXCR3基因的表達

為了驗證TCGA和LCI數(shù)據(jù)庫的結(jié)果，我們采用qPCR方法檢測了45例乙肝相關(guān)HCC中CXCL10和CXCR3基因的表達水平，并以8例正常肝組織作為對照，結(jié)果顯示CXCL10基因在乙肝相關(guān)HCC和配對癌旁組織里的表達均顯著高于正常肝組織(P=0.010，P<0.001)，但CXCL10基因表達水平在HCC和配對癌旁組織中的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=1.000，圖3A)。同樣，CXCR3基因在HCC和配對癌旁組織里的表達水平也顯著高于正常肝組織(P=0.004，P<0.001)，但其在HCC組織中的表達水平與配對癌旁組織相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.374，圖3B)。

A, mRNA expression of CXCL10 in HCC (n=45), non-tumor (n=45) and nomal (n=8) tissues; B, mRNA expression of CXCR3 in HCC (n=45), non-tumor (n=45) and normal (n=8) tissues. Results were showed as M (P25，P75).圖3 qPCR方法檢測45例乙肝相關(guān)HCC樣本中CXCL10和CXCR3基因的表達Figure 3 mRNA expression of CXCL10 and CXCR3 of 45 HCC clinical samples with HBV infection background detected by qPCR

2.4 CXCL10與CXCR3基因表達水平在HCC和癌旁組織中的相關(guān)性

我們進一步分析了來自TCGA、LCI數(shù)據(jù)庫以及我們檢測的臨床樣本中CXCL10基因與CXCR3基因表達水平的相關(guān)性，結(jié)果如圖4所示，在HCC組織中，來自TCGA數(shù)據(jù)庫的CXCL10基因與CXCR3基因的表達水平間呈顯著正相關(guān)，但在LCI數(shù)據(jù)庫以及我們的臨床樣本中未見明顯相關(guān)性(圖4A)，這一現(xiàn)象同樣存在于癌旁組織中(圖4B)。

A, correlation between the expression level of CXCL10 and CXCR3 in tumor tissues in TCGA datebase, LCI database and clinical samples; B, correlation between the expression level of CXCL10 and CXCR3 in non-tumor tissues in TCGA datebase, LCI database and clinical samples.圖4 CXCL10與CXCR3基因表達水平在HCC和癌旁組織中的相關(guān)性分析Figure 4 Correlation between the expression level of CXCL10 and CXCR3 in tumor and non-tumor tissues

3 討論

作為腫瘤細胞賴以生存的場所，腫瘤微環(huán)境可直接影響腫瘤細胞的生長、轉(zhuǎn)移及預(yù)后[6]，因此研究腫瘤微環(huán)境的特點及功能可為腫瘤的早期診斷和治療提供新依據(jù)。趨化因子及其受體之間的相互作用是腫瘤微環(huán)境的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，在促進腫瘤細胞增殖、招募免疫細胞及重塑細胞外基質(zhì)等方面發(fā)揮重要作用。已有研究表明，CXCL10基因可通過招募表達CXCR3基因的T細胞、B細胞、單核/巨噬細胞和自然殺傷細胞等，參與多種炎癥性疾病和腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[7]。CXCL10/CXCR3在胃癌、乳腺癌、肺癌和多發(fā)性骨肉瘤組織中呈高表達，且與上述腫瘤的惡性表型密切相關(guān)[7]，但CXCL10/CXCR3在HCC中的表達及作用鮮見報道。

CXCL10基因主要由成纖維細胞、內(nèi)皮細胞、肝實質(zhì)細胞、角化細胞等多種細胞表達。在細胞處于穩(wěn)態(tài)條件下，CXCL10基因呈低表達，但在炎癥細胞因子刺激下CXCL10基因表達上調(diào)。CXCL10基因的表達主要由IFN-γ誘導(dǎo)，其主要作用是趨化T淋巴細胞、單核細胞、自然殺傷細胞到達炎癥部位，發(fā)揮抗炎免疫作用。CXCL10基因也是一種血管抑制因子，可招募抗腫瘤T淋巴細胞，發(fā)揮潛在的抗腫瘤效應(yīng)，但腫瘤細胞的自分泌CXCL10信號也能促進腫瘤細胞的增殖、血管生成和轉(zhuǎn)移[7]。Ren等[8]的研究發(fā)現(xiàn)，HCC組織中CXCL10基因表達上調(diào)，且CXCL10基因高表達與HCC患者的總體生存率呈負相關(guān)，但也有研究表明[9-10]，HCC組織中CXCL10基因的表達水平與Th1、CD8+T細胞和自然殺傷樣T細胞的浸潤呈正相關(guān)，提示在某些HCC患者中CXCL10基因可能是通過增強抗腫瘤免疫抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，從而利于HCC患者的預(yù)后。為了進一步驗證組織中CXCL10基因的表達水平與患者預(yù)后的關(guān)系，我們分析了TCGA和LCI數(shù)據(jù)庫中CXCL10基因的表達情況及其與預(yù)后的關(guān)系。與Ren等[8]的發(fā)現(xiàn)一致，本研究結(jié)果顯示CXCL10基因在HCC組織中的表達顯著高于癌旁組織，但不同的是，CXCL10基因高表達HCC患者的總體生存率顯著高于CXCL10基因低表達HCC患者，提示CXCL10基因高表達利于HCC患者的預(yù)后。此外，我們也在45例乙肝相關(guān)HCC樣本中驗證了CXCL10基因在HCC組織的高表達，但HCC和癌旁組織中CXCL10基因水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義，可能與我們所檢測癌旁組織均有肝硬化背景有關(guān)。

已有研究表明，CXCR3基因在乳腺癌、骨髓瘤、結(jié)腸癌等多種腫瘤中異常表達，且與腫瘤的轉(zhuǎn)移和預(yù)后相關(guān)[9]。Ding等[11]和任穎等[12]的研究表明，HCC組織中CXCR3基因表達水平高于癌旁組織，HCC組織中CXCR3蛋白的陽性率也高于癌旁組織，且CXCR3蛋白陽性患者術(shù)后總體生存率低于陰性患者。本研究來自TCGA數(shù)據(jù)庫370例HCC患者的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)顯示，CXCR3基因在HCC組織中的表達水平顯著高于癌旁組織，且CXCR3基因高表達利于HCC患者的預(yù)后，但來自LCI數(shù)據(jù)庫乙肝相關(guān)肝癌的分析結(jié)果與TCGA相反，CXCR3基因在HCC組織中的表達水平低于配對癌旁組織，而CXCR3基因高表達的HCC患者同樣預(yù)后更好。我們檢測了CXCR3基因在45例乙肝相關(guān)HCC中的表達，CXCR3基因在HCC組織和癌旁組織中的表達差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義，但趨勢與LCI數(shù)據(jù)庫一致。本研究檢測的45例HCC樣本和LCI數(shù)據(jù)庫里納入的204例HCC均有HBV感染背景，TCGA數(shù)據(jù)庫中僅有102例HCC患者有HBV感染，而Ding等[11]和任穎等[12]的研究沒有分析HCC患者的慢性乙肝背景，提示不同研究中CXCR3基因表達不一致的原因可能與HCC患者的病因不同有關(guān)。與此結(jié)果一致的是，CXCL10基因和CXCR3基因表達水平呈正相關(guān)的現(xiàn)象僅存在于TCGA數(shù)據(jù)庫，但在LCI數(shù)據(jù)庫和我們檢測的樣本中這種相關(guān)性消失。由于HCC中浸潤的淋巴細胞也可以表達CXCR3基因，淋巴細胞浸潤程度會影響CXCR3基因mRNA水平的檢測。此外，CXCR3基因有3個剪接異構(gòu)體，分別為CXCR3A、CXCR3B和CXCR3alt。研究表明，不同CXCR3基因亞型的功能及分布不同。CXCR3A激活可誘發(fā)細胞的趨化和增殖，而CXCR3B激活則抑制細胞的遷移和增殖，促進凋亡[13]。本研究定量檢測的是CXCR3B亞型，其在乙肝相關(guān)肝癌中的低表達可能與腫瘤的發(fā)生有關(guān),但TCGA、LCI數(shù)據(jù)庫以及另外兩項研究中均未注明所檢測的CXCR3基因亞型，因此，不同研究中的CXCR3基因表達結(jié)果不一致也可能與所檢測的亞型不同有關(guān)。

綜上所述，本研究結(jié)果證實CXCL10基因在不同病因的HCC組織中均呈高表達，而CXCR3基因在乙肝相關(guān)HCC組織中呈低表達，且CXCL10基因和CXCR3基因的高表達利于HCC患者的術(shù)后生存，提示CXCL10基因和CXCR3基因在HCC的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要的作用。

(志謝：鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院肝膽胰外科張玲教授提供肝組織樣本)