腦組織液引流途徑與腦內新分區系統的發現

韓鴻賓

(北京大學第三醫院放射科，磁共振成像與技術北京市重點實驗室，北京 100191)

百余年來，基于“細胞學說”的腦科學一直圍繞“神經元學說”和“突觸學說”展開系列研究，在各類腦細胞和神經網絡研究方面的學術成績斐然。然而，從臨床角度來看,多數腦病治療卻并未因學術的進步而取得理想的效果。腦卒中、阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)等依然摧殘著人類的健康與尊嚴，認知、記憶依然是未解之謎[1-2]。回顧歷史，從腦結構角度，腦科學研究體系尚存在未被充分認識的結構空間——腦細胞外間隙(extracellular space，ECS)[3]。腦ECS是38～64 nm寬的不規則形、多孔隙結構，占活體腦容積的15%～20%[4]，而以往備受重視的腦血管系統僅占據腦容積的3%～5%。以往業界認為ECS只起到細胞間支撐和黏附的物理作用，近年來，隨著探測方法的發展和進步，研究結果表明ECS在維持腦局部內環境穩態、細胞間信息傳遞、細胞遷移，乃至認知、睡眠等方面均發揮著重要作用[5-10]。

本文對課題組在腦細胞外間隙領域探索的歷史、技術方法的建立以及新技術、新發現在腦結構認識、腦病診治、新藥研發等前沿科學領域的應用進行系統性回顧，對所建立新方法的原理和技術進行介紹，重點綜述應用新技術在腦結構和腦組織液引流途徑等方面的科學發現。在闡述根據新發現提出的理論假說的同時，討論細胞外間隙在腦科學、藥學、航天領域、人工智能、腫瘤治療等前沿領域的應用和未來發展前景。

1 攻關腦卒中診治難題，發現腦內未知結構空間

筆者從20世紀90年代初開始從事腦卒中的超早期診斷與動脈溶通介入治療研究，針對腦卒中缺少超早期診斷技術的臨床難題，在國內影像界率先開展應用磁共振擴散成像診斷超早期腦缺血的臨床工作[11-12]。在細胞和離子代謝水平闡明了缺血區水分子擴散運動異常的機制，并在此基礎上，聯合應用灌注成像解決了缺血半暗帶的影像診斷難題。值得一提的是，為了闡明缺血區水分子布朗運動下降的機制，需要對磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)的工作原理、序列設計以及水分子擴散運動測量分析的機制進行深入掌握，因此，借助北京大學與北京醫科大學合校之機，筆者在北京大學自修電磁學、數學、計算機課程，并于2000年在美國獲得磁共振序列設計工程師資格認證。利用所學研發了多項磁共振成像新技術、新序列，其中出血診斷序列的研發早于歐美公司在北美放射學會(Radiological Society of North America，RSNA)上的亮點技術發布[13]，這種理工科的學習背景不僅對后續攻關活體超微結構空間的成像分析技術奠定了基礎，同時也為2003年嚴重急性呼吸綜合征 (severe acute res-piratory syndrome，SARS)災情的應急處理做出貢獻。在2003年SARS爆發期間，針對北京大學第三醫院重災區的特殊情況，筆者利用所掌握的醫學圖像處理工程技術，為北京大學第三醫院設計、建立了應急隔離信息系統，保護了醫院醫護人員和患者的健康，研究結果發表于《北京大學學報(醫學版)》SARS?？痆14]，引起東南亞國家衛生防疫部門關注。上述研究在當時獲得了北京市青年創新成果一等獎(2003年)、中華醫學科技獎二等獎(2005年)。

在攻克腦缺血超早期診斷難題后，為了解決神經保護藥物通過血腦屏障(blood brain barrier，BBB)的難題，筆者從2004年開始對BBB通透性的定量分析進行攻關，為學習和掌握半透膜工作原理和數學建模計算留學德國。在解決受損BBB通透性的定量分析難題的同時，意外發現腦內存在一個描述ECS的特征參數[15]，提示腦血管和腦細胞外還存在一個未知的結構空間，即ECS。在2004年到2007年間，通過系統回顧腦科學的發展歷史和文獻，發現ECS是尚未被充分認識和利用的重要結構空間[3]。結合當時腦卒中的神經保護藥物研發的失敗境遇[16]，故決定帶領團隊開始對腦ECS探測進行攻關。

2 發明新型探測方法，揭示腦ECS結構特征，發現腦內新分區系統

由于腦內缺乏內源性特異性分布于ECS的可被探測的分子結構，所以對ECS的探測需導入外源性分子探針，以此來獲取來自ECS的信號。腦ECS活體測量技術需要4個基本過程：(1)將特異性分布于細胞外間隙的分子探針導入ECS；(2)高靈敏度的采集來自細胞外間隙的探針信號；(3)對檢測到的信號通過處理，實現對探針濃度的精準定量分析；(4)根據數學建模計算，獲取腦ECS的結構特征參數。由于活體腦細胞間隙是納米尺度的超微結構，其尺度遠小于現有活體成像的儀器設備的探測空間分辨能力，因此，對探針在ECS內的精準分布的特異性要做嚴格要求，也就是探針需要嚴格的分布于細胞外間隙，不逆向經過BBB回流入血管內，不被神經元和膠質細胞所攝取，要摸索探針的有效工作濃度區間，探針信號的可探測性，同時還要考慮探針的毒性、生物相容性等。從2004年開始，本課題組聯合中國科學院化學研究所的專家進行系統攻關，為了找到特異性分布于腦ECS內的合適探針，對十幾種探針進行篩選，并探索合成新型分子探針。經過5年多的潛心研究，課題組篩選出了最佳的磁敏感性分子探針[17-19]。結合后續探測工作和其他學科的需求，這項工作一直延續至今，課題組聯合北京大學藥學院成功研制了光磁雙模態分子探針，新型探針在腦ECS的結構分析和功能研究上發揮了作用[20-21]。

在解決了探測腦ECS空間信號的技術難題后，根據具體的信號采集與測量分析流程以及擴散方程求解的基本要求，本課題組進一步設計和搭建了ECS的信號檢測與定量分析系統。因為采用射頻作為信號源，在原理層面突破了以往以電信號和光信號為源的探測技術在探測深度和維度上的技術限制，解決了腦深部ECS信號采集的技術難題。應用磁共振成像儀作為信號的采集平臺，實現了對ECS結構特征以及其內組織液引流的動態可視化觀察；并且由于探測系統提供了豐富的時間和空間信息，研制的磁示蹤檢測法成為唯一實現三維各向異性建模的測量分析方法[22-24]，為在全腦三維空間角度解密ECS提供技術支撐，該方法于2013年獲批國家發明專利。

磁示蹤法與國際通用的其他兩類測量技術(電化學法和光示蹤法)的原理和技術指標比較如下：(1)電化學法，采用帶電離子為示蹤探針(三甲胺正離子，TMA+)， 經導入探針電極導入后，由放置在200 μm距離內的探測電極測量電位變化，在換算為離子濃度后，利用經典擴散方程求解局部兩點間腦ECS結構參數；(2)光示蹤法，采用熒光分子作為探針，導入ECS后，在激發光的作用下，采用共聚焦顯微鏡觀察腦淺表區200 μm深度以內的ECS內探針的分布擴散情況；(3)磁示蹤法，采用鑭系金屬離子螯合物作為磁敏性探針，導入ECS后，可作用于與探針相距(2.41～2.44)×10-4μm的水分子中氫原子，縮短其縱向弛豫時間，在MRI圖像上表現為信號增強，應用動態掃描獲得像素內分子探針動態分布過程，應用對流擴散方程求解獲取ECS結構參數。

由于本課題組所研發的新方法在探測技術性能上的進步，使我們對腦結構的認識有了新的突破。我們發現腦內存在新的分區系統，即腦ECS內組織液的引流被局限在不同的分區，不同分區內ECS結構特征不同，分區內組織液的引流途徑也各不相同，這一發現糾正了腦ECS是高度通連系統的錯誤認識[25]。比如，尾狀核區ECS內腦組織液(brain interstitial fluid，ISF)， 沿著神經纖維向同側皮層區單向引流，達到皮層區后進入蛛網膜下腔[22]。盡管尾狀核緊鄰丘腦，但是尾狀核區ISF并不會流向丘腦區，而是選擇向相反方向引流至更遠距離的大腦皮層。同樣，丘腦區ECS內分子也無法跨越丘腦與尾狀核之間的屏障結構[26]，其引流局限于丘腦區，直接引流入腦室和蛛網膜下腔。課題組進一步證實了阻隔ECS內物質轉運的分區屏障的結構為致密有髓神經纖維束[27]。當腫瘤或化學毒物導致屏障結構損傷時，原本互不溝通的ECS分區發生ISF溝通，腦局部的穩態遭到破壞，不同腦ECS分區內的腦細胞和神經網絡的工作環境發生異常[28]?；谶@一發現，課題組提出腦分區穩態理論假說[4]，即腦不僅依靠血腦屏障阻擋外來有害物質，同時還依賴腦內ECS分區屏障結構避免不同腦區之間的溝通和物質交換，從而實現不同區域局部工作環境的穩定性，腦分區穩態理論以封面故事發表于ProgressinNeurobiology[4]。由于上述腦細胞外間隙探索工作的成績，研究團隊獲得了2015年華夏醫學科技獎一等獎，筆者獲第十二屆中國青年科技獎。

隨著磁示蹤法的應用，不同腦區ECS內ISF的引流途徑被逐個揭示[29]。腦內新分區系統的發現將對腦基礎研究、藥學、神經外科、神經內科、兒科、老年病科、精神科，甚至航空航天等特種醫學產生重大而深遠的影響，其中最令我們感興趣的是新發現的腦分區引流系統是否可以用來作為新的給藥途徑？以往失敗的腦缺血神經保護藥物是否可以通過這個給藥途徑得以“復活”，如何繞過血腦屏障的阻礙更高效地發揮神經保護作用？

3 腦ECS新發現與新理論在醫學前沿領域的應用

為證實ECS是否可以用來作為給藥途徑，課題組采用大鼠大腦中動脈閉塞模型(middle cerebral artery occlusion, MCAO)， 對大腦中動脈供血區所在的ECS分區中ISF引流的上游區域作為藥物導入點，根據水溶性小分子擴散速率，模擬計算藥物分子在ECS內的分布以及到達擬保護區的時間和濃度范圍，最終采用預防性給藥，僅應用了常規給藥劑量1/800的胞嘧啶核苷二磷酸膽堿(cytidine diphosphate choline, CDPC)， 就實現了好于常規給藥途徑6倍的神經保護效果[30]。由于我們課題組在腦分區系統的新發現，提出的新方法比美國國家防務機構從哈佛大學購買的對流增強給藥專利技術更加的微創、高效，該方法于2015年獲批國際發明專利[31]。

經ECS途徑的新型給藥方法成功繞過了阻礙大多數藥物入腦的血腦屏障，為以往經口服和靜脈給藥途徑研發失敗的多數藥物帶來新的希望。課題組在近5年設計并逐步開展了將腦細胞外間隙的新發現和新理論推向臨床應用的前期準備工作，包括：(1)建立無創的、無需探針導入的ECS定量分析方法；(2)研究ECS和ISF引流的各類病理改變；(3)研究ECS與腦細胞或者神經網絡興奮工作的關系；(4)探索ECS內藥物轉運或者清除的調控方式與機制等。

本課題組首先應用痛覺刺激模型證實丘腦區神經元興奮可明顯降低該區ECS內ISF的引流速率[32]，應用水通道蛋白4(aquaporin 4, AQP4)基因敲除模型，證實了神經興奮導致ISF引流速度下降的機制以及AQP4對腦ISF引流的影響[33]。從發育到成熟再到退變，ECS和ISF出現規律性的改變[34]。C6膠質瘤侵襲ISF引流分區屏障結構后，會導致ISF引流紊亂[28]。在帕金森病動物模型中，紅花黃酮類提取物可改變腦ECS結構，發揮神經保護作用[35-36]。2018年9月，課題組成功研制無創ECS測量技術，為經ECS途徑的臨床腦病診治奠定基礎[37]。

隨著腦細胞外間隙研究和認識的深入，腦研究將有望實現從僅考慮腦細胞和血管的兩室模式向三室模式升級，兼顧腦細胞、細胞外間隙和腦血管的新型研究模式將為認識腦、利用腦和保護腦提供全新的視角和方向[4]。將神經網絡微環境引入人工智能網絡建模的探索工作已經開始，未來應用值得期待[38]。

本課題組在ECS研究領域的研究歷程見圖1。

During 1993-2003, when studying the early diagnosis of cerebral ischemic stroke and the quantitative analysis of the blood brain barrier permeability, a parameter of extracellular space was derived from the raw data of permeability of blood brain barrier. Dr. Han realized that the brain extracellular space is an unknown space to neuroscience and decided to explore the space since then. In 2004, Dr. Han proposed and established a novel method of measuring the brain extracellular space, magnetic resonance tracer based method to detect brain extracellular space, the measuring system was finally finished and got patented in 2013. In 2015, by using the newly developed method, Dr. Han and his group discovered that a new division system in the brain: the brain interstitial fluid drains in a regionalized extracellular space system. Based on the above findings, Dr. Han and his fellows designed and developed a new drug delivery method, by which the drug was delivered via brain extracellular space and bypass the obstacle of the blood-brain barrier as it does with the routine oral or intravenous administration. In 2017, the barrier structure to impede the brain interstitial fluid drainage was identified as the compact fiber fascicles in the deep brain, and a new hypothesis of local brain homeostasis within each extracellular space divisions was therefore proposed and published the cover story in the journal of Progress in Neurobiology. In pre-sent, new method and discoveries have been applied in several frontier fields such as neuroscience, pharmacy, aerospace, artificial intelligence, as well as tumor therapy.圖1 腦細胞外間隙探測研究歷程圖Figure 1 History of exploring the brain extracellular space