QuEChERS結合UPLC-MS/MS測定菠菜中5種氨基甲酸酯類農藥殘留

馮婉瑩， 羅 浩， 黃澤濤

(廣州檢驗檢測認證集團有限公司， 廣東 廣州 511447)

氨基甲酸酯是一類以甲酸酯為前體化合物合成得到的農藥，在我國農產品行業中應用廣泛[1]。氨基甲酸酯除殺蟲外，還具有促進作物生長的效果[2]，因此容易被濫用。而氨基甲酸酯毒性大，且缺乏選擇性，會對人類和動物健康及水生系統構成威脅[3]。相關研究表明，氨基甲酸酯會對外周和中樞神經系統，肌肉、肝臟、胰腺和腦等器官造成影響[4]。

目前，對氨基甲酸酯類農藥的測定方法主要有氣相色譜法[5]、液相色譜法[6-7]、氣相色譜- 質譜法[8-9]和液相色譜- 串聯質譜法[10-13]，還有酶抑制法和免疫法[14-15]。氣相色譜法試劑用量大，且需要濃縮，操作煩瑣，不利于大批量檢測。液相色譜法檢測限高，或需要進行衍生，同樣不適用于日常檢測。氣相色譜- 質譜法對熱不穩定的化合物檢測難度大。而酶抑制測定和免疫測定則存在實驗影響因素多和檢測成本高等問題。文章基于QuEChERS技術建立了測定菠菜中5種氨基甲酸酯類農藥的超高效液相色譜- 串聯質譜法(UPLC- MS/MS)，該方法操作簡便、快速高效且回收率高、重現性好，適用于實驗室的日常分析測定，為相關檢測方法的研究提供了參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氨基甲酸酯標準品(霜霉威、滅多威、異丙威、抗蚜威、丁硫克百威)，質量濃度均為1 000 mg/L，上海安譜實驗科技股份有限公司；乙腈、甲酸(色譜純)，美國Fisher公司；N-丙基乙二胺(PSA)、石墨化碳黑(GCB)、C18固相吸附劑，安捷倫科技公司；無水硫酸鎂、氯化鈉(分析純)，廣州化學試劑廠。實驗用水為經Milli- Q型凈化系統過濾的超純水，電阻率為18.2 MΩ·cm。

1.2 儀器與設備

安捷倫1200型高效液相色譜- 三重四極桿串聯質譜儀，美國AB公司；Heidolph Multi Reax型渦旋振蕩器，德國Heidolph公司；TGL- 16MH2050R型高速離心機，湖南湘儀離心機儀器有限公司；Milli- Q型超純水裝置，美國Millipore公司。

1.3 實驗方法

1.3.1標準溶液的配制

分別取0.1 mL 1 000 mg/L的氨基甲酸酯標準儲備液于10 mL容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，得到10 mg/L的標準中間液。取適量10 mg/L標準中間液用空白基質溶液稀釋成質量濃度分別為0.1、0.2、0.5、1.0、5.0、10.0、20.0 μg/L的基質工作液，空白基質溶液由5種氨基甲酸酯呈陰性的樣品處理后得到。

1.3.2樣品前處理

提取：稱取5 g均質后的樣品于50 mL離心管，加入10 mL水和10 mL乙腈，渦旋混勻1 min，加入4 g無水硫酸鎂和1 g氯化鈉，渦旋提取5 min，10 000 r/min離心5 min。

QuEChERS凈化：稱取PSA 固相吸附劑200 mg和無水硫酸鎂50 mg于1.5 mL離心管中，加入上清液1 mL，渦旋2 min，12 000 r/min離心5 min，過0.22 μm有機濾膜后待UPLC- MS/MS測定。

1.4 色譜及質譜條件

1.4.1色譜條件

色譜柱：Agilent Proshell C18(150 mm×3.0 mm，2.7 μm)；流動相A：乙腈；流動相B：體積分數0.1%甲酸；流速：0.4 mL/min；進樣量：10 μL；柱溫：40 ℃；等度洗脫，流動相組分比例A∶B為75∶25。

1.4.2質譜條件

掃描方式：電噴霧電離源(ESI+)；氣簾氣：25 psi；電離電壓：5 500 V；離子源溫度：500 ℃；霧化氣：50 psi；加熱輔助氣：50 psi；碰撞氣：medium；采集模式：多反應監測(multi-reaction monitoring, MRM)模式。

2 結果與討論

2.1 色譜條件的優化

由于5種氨基甲酸酯農藥含有胺基結構，屬于親核型化合物。因此，實驗對比了乙腈- 水和乙腈- 0.1%甲酸流動相對5種目標物響應值的影響。結果發現，以乙腈- 0.1%甲酸作為流動相，5種目標物在電離源中能更好地離子化，響應值更高。同時調整了洗脫梯度對5種氨基甲酸酯進行分離，但由于異丙威和抗蚜威極性相近，使用梯度洗脫仍難以使2種化合物分離。而5種氨基甲酸酯的母離子均不一樣，因此，最終采用等度流動相進行洗脫。當水相超過25%時，5種氨基甲酸酯出峰時間均延后，丁硫克百威峰型變寬，所以最終使用流動相為乙腈- 0.1%甲酸(體積比75∶25)。5種氨基甲酸酯MRM色譜圖見圖1。

圖1 5種氨基甲酸酯的MRM色譜Fig.1 MRM chromatograms of five carbamate pesticides

2.2 質譜分析參數的優化

由于5種氨基甲酸酯農藥呈弱堿性，在電噴霧正離子模式下形成的準分子離子峰中[M+H]+豐度最高。以流動注射的方式在電噴霧正離子模式下，對母離子進行二級質譜掃描，選擇豐度較高的2個碎片離子作為定量和定性離子，通過MRM模式分別優化各個離子對的去簇電壓(DP)和碰撞電壓(CE)等參數條件，以達到檢測的最佳靈敏度(見表1)。

2.3 乙腈用量對回收率的影響

實驗前期優化時發現，渦旋振搖1 min以上基本可完成提取，因此不對提取時間詳細探究；而在純水用量10 mL條件下，探究乙腈用量對回收率的影響，見圖2。結果發現，當乙腈用量為10 mL時，5種氨基甲酸酯的回收率基本滿足測定要求；用量繼續增加，回收率無明顯變化。考慮到稀釋倍數越大，方法檢出限越高，因此選取10 mL為乙腈提取用量。

表1 5種氨基甲酸酯的質譜分析參數

*為定量離子。

圖2 乙腈用量與回收率的關系Fig.2 Relationship between acetonitrile dosages and recovery rates

2.4 PSA用量對回收率的影響

菠菜樣品中含有的大量天然色素和其他極性較大的雜質對5種氨基甲酸酯有較大的基質效應影響。實驗采用PSA、GCB和C18固相吸附劑對處理后的溶液進行凈化。結果發現，GCB對5種氨基甲酸酯有較明顯的吸附作用，導致回收率降低，其次是C18。PSA對5種氨基甲酸酯的吸附較少，且能較好地去除基質效應，最終選取PSA進行凈化；但基質效應仍較明顯，導致回收率只有40%～50%，因此也需要采用空白基質曲線進行校準。優化后選取PSA用量為200 mg，見圖3。

圖3 PSA用量與回收率的關系Fig.3 Relationship between PSA dosages and recovery rates

2.5 線性關系、檢出限和定量限分析

采用外標法對5種目標物進行定量，將空白基質溶液配制的標準溶液按優化后的儀器條件進行測定。以質量濃度為橫坐標(X)，定量離子對峰面積為縱坐標(Y)進行線性回歸分析，所得方程見表2，相關系數r均大于0.999 1。結果表明，5種目標物在給定的范圍內呈良好線性關系，以信噪比RS/N=3和RS/N=10分別計算出方法檢出限(LOD)和方法定量限(LOQ)，異丙威和丁硫克百威分別為0.20 μg/kg和0.50 μg/kg，其他3種化合物分別為0.10 μg/kg和0.25 μg/kg，表明方法靈敏度達到分析測定要求。

表2 5種氨基甲酸酯線性方程、相關系數和檢出限

2.6 精密度、回收率及重復性分析

選用陰性樣品，以定量限的1、2、10倍進行3個水平的加標回收實驗，每個加標水平分別日內進行6次平行測定。菠菜樣品的平均回收率范圍在91.0%～101.0%，相對標準偏差RSD在2.15%～5.57%(見表3)。說明方法回收率高，重現性好，能滿足分析測定要求。

表3 5種氨基甲酸酯的回收率和精密度

3 結 論

研究基于QuEChERS技術結合UPLC- MS/MS，建立了菠菜中5種氨基甲酸酯的測定方法。利用PSA對樣品提取液進行凈化，有效地降低了基質效應對回收率的影響，大大提高了方法靈敏度。優化超高效液相色譜條件后，5種氨基甲酸酯在9 min內出峰，且峰型良好。使用空白基質曲線進行校正，根據相關方法學實驗結果表明，實驗所用方法簡單便捷，回收率高且精密度高，為氨基甲酸酯類農藥殘留量的檢測研究提供了參考。