宮廷奶酪中優良乳酸菌菌株的分離與鑒定

吳鳳玉， 鄭 喆， 李 柳， 吳夢盈， 楊昊寰， 楊貞耐

(北京工商大學 北京食品營養與人類健康高精尖創新中心/食品添加劑與配料北京市高等學校工程中心， 北京 100048)

宮廷奶酪，也稱為米奶酒或扣碗酪，是我國北方少數民族的傳統乳制品。這種利用牛乳汁與米酒混合制成的半凝固食品，口感軟嫩爽滑，具有獨特的酒香與奶香，很容易被我國消費者接受。宮廷奶酪口感與風味的形成與其發酵過程中米酒微生物的作用密切相關[1]。騰軍偉等[2-3]在酒曲中分離得到11株細菌和2株真菌，篩選出1株高產凝乳酶的解淀粉芽孢桿菌； Liu等[4]分析了紹興黃酒中的微生物，發現芽孢桿菌和明串珠菌等為主要菌屬；Lv等[5]報道傳統米酒發酵起始物中的優勢菌株為乳酸菌和芽孢桿菌；Huang等[6]報道紅曲糯米酒中隨著發酵的進行，乳桿菌和明串珠菌成為主要菌屬。甜酒曲中也存在豐富的乳酸菌如腸球菌，乳桿菌等。乳酸菌在發酵過程中可能由于氧和營養成分的變化而產生不同的有機酸[7]，不僅是酸香味的主要來源，還具有抑制有害菌生長的特性[8]。然而，有關米酒微生物發酵制作的宮廷奶酪中乳酸菌的分離鑒定及其功能特性的研究較少。

研究采集了4種北京市售宮廷奶酪，采用形態學觀察、生理生化實驗以及16S rDNA分子生物學鑒定方法，結合菌株的抑菌作用、抗氧化活性和產酸能力測定，分離篩選乳酸菌優良菌株，為進一步研究開發功能性乳制品奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

實驗樣品：宮廷奶酪樣品來自4個市售品牌。

指示菌：大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、阪琦桿菌、志賀氏菌、沙門氏菌、李斯特菌，菌株由北京工商大學乳品實驗室菌種保藏庫保藏。

1.2 儀器與設備

BX53型顯微鏡，日本Olympus公司；U- 3900型分光光度計，日本HITACHI公司；HZQ- Q型氣浴恒溫搖床，上海一恒科學儀器有限公司；VCX500型細胞破碎儀，美國Sonics公司。

1.3 實驗方法

1.3.1培養基的配制

MRS液體培養基：蛋白胨10 g、牛肉膏5 g、酵母粉4 g、葡萄糖20 g、吐溫80 1 mL、K2HPO4·7H2O 2 g、無水乙酸鈉3.02 g、檸檬酸三銨2 g，MnSO4·4H2O 0.05 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、瓊脂15 g、蒸餾水1 000 mL,將培養基調至pH值6.2，121 ℃滅菌15 min。

MRS固體培養基：向100 mL液體培養基中添加2 g瓊脂，121 ℃，15 min滅菌。

鈣平板培養基：向100 mL固體培養基中添加1 g的碳酸鈣，121 ℃，15 min滅菌。

1.3.2乳酸菌的初篩

取10 g的樣品于100 mL MRS液體培養基中，37 ℃富集培養，將富集培養的樣品用質量分數0.9%的生理鹽水做梯度稀釋，取合適梯度平板涂布，37 ℃培養48 h。挑取單菌落對其進行平板劃線分離純化，得到形態一致的單一菌落。

1.3.3乳酸菌的復篩

鈣平板實驗：將初篩的菌株活化后用三點法接種到鈣平板培養基，37 ℃恒溫培養24 h，觀察是否產生溶鈣圈。

過氧化氫酶實驗: 挑取純培養物1環于載玻片上，與體積分數3%H2O2混勻，若有氣泡產生，為陽性，反之為陰性。

1.3.4基于16S rDNA的菌種分子生物學鑒定

將樣品送至北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司測序。測序結果與Gen Bank中已知菌株的相應序列進行比對，利用MEGA 6.0軟件將實驗菌株與選取的序列相似性較高的菌株序列進行對比分析，構建系統發育進化樹。

1.3.5乳酸菌發酵液抑菌活性測定

采用牛津杯法[9]，取200 μL濃度一定的指示菌懸液在LB平板培養基上涂布。將滅菌后的牛津杯放置在平板上，吸取200 μL離心后的發酵液于牛津杯中，37 ℃培養24 h，測定抑菌圈直徑大小。

1.3.6乳酸菌羥自由基清除能力測定

樣品制備：將乳酸菌37 ℃培養24 h，6 000 r/min離心，用PBS(pH值7.2)緩沖溶液洗滌3次，重懸。調整菌懸液濃度為109CFU/mL，從而制得菌體細胞。取10 mL調好濃度的菌體細胞懸液置于冰浴中超聲破碎，設置超聲破碎時間為30 min，超聲4 s，間隔5 s，超聲探頭溫度4 ℃。8 000 r/min離心10 min，離心后獲得的上清液即為無細胞提取液。破碎率計算見式(1)。

(1)

式(1)中，N表示原始細胞數量，N0表示破碎后完整細胞數量。

采用Fenton法[10]，取1 mL菌體細胞懸液和無細胞提取物，在試管中依次加入1 mL 0.435 mmol/L 亮綠，2 mL 0.5 mmol/L 硫酸亞鐵，1.5 mL體積分數3% H2O2，37 ℃水浴20 min后在624 nm處測定上清液吸光度。羥自由基清除率計算見式(2)。

(2)

式(2)中，A1表示Fenton試劑、亮綠及樣品的吸光度，A0表示Fenton試劑與亮綠的吸光度，A表示亮綠的吸光度。

1.3.7乳酸菌DPPH自由基清除能力測定

樣品制備同1.3.6節，向1 mL菌體細胞懸液和無細胞提取物中加入2 mL 0.5 mmol/L DPPH和體積分數95%乙醇溶液，充分混勻，室溫下避光靜置，反應30 min，8 000 r/min離心10 min，取上清液519 nm處測吸光度。DPPH自由基清除率計算見式(3)。

(3)

式(3)中，A1表示DPPH乙醇溶液與樣品的吸光度，A0表示樣品與乙醇溶液的吸光度，AC表示DPPH乙醇溶液的吸光度。

空白組以等體積的乙醇溶液代替DPPH乙醇溶液；對照組以等體積的無菌水代替菌體細胞懸液和無細胞提取液。

1.4 數據分析

用SPSS 17.0軟件進行方差分析，Origin 8.6軟件繪圖。

2 結果與討論

2.1 乳酸菌的篩選結果

富集培養的樣品經過稀釋涂布平板法和平板劃線法分離純化后，共得到15株菌株。菌株產酸實驗結果如圖1。與原始MRS培養基pH值相比,除MRSC1菌株以外，其余菌株發酵液pH值都有明顯下降；其中菌株MRSA1、MRSA2、MRSB1、MRSD3發酵液與初始發酵液相比，pH值下降明顯，培養24 h后，發酵液pH值分別低至3.73、3.79、3.71、3.87，產酸效果較其他菌株更好。

圖1 初篩菌株發酵液pH值Fig.1 pH values of fermentation liquor of isolated strains

對菌株MRSA1、MRSA2、MRSB1、MRSD3進行鈣平板鑒定、革蘭氏染色、過氧化氫酶實驗以及菌落特性和菌體形態觀察，結果見表1。4株菌在鈣平板上均有透明圈出現，說明菌株產酸，使得pH值降低，平板中碳酸鈣溶解，形成透明圈。根據其良好的產酸能力、革蘭氏染色陽性、過氧化氫酶實驗陰性等特性，初步判斷此4株菌為乳酸菌。

2.2 16S rDNA基因序列同源性比對與系統發育分析

將菌株MRSA1、MRSA2、MRSB1、MRSD3的16S rDNA基因序列與Gene Bank內已知菌株的相應序列進行對比，通過同源性比對結果構建系統發育樹，結果如圖2。菌株MRSA2、MRSD3與LeuconostoclactisLMAU40043在同一分支上，且通過Bootstrap的驗證表明它們具有較高的置信度，支持率達到100%，因此可將MRSA2、MRSD3鑒定為乳明串珠菌。明串珠菌屬通常存在于乳制品、肉類或其他食品中[11]。與其他乳酸菌一樣，明串珠菌屬是重要的工業發酵微生物，用于多種工業和食品發酵過程，如奶酪、黃油、酸奶和泡菜的生產[12]。 明串珠菌是乳制品生產中重要的風味微生物[13]，在風味酸奶、干酪生產中應用較多，其通過代謝檸檬酸鹽等有機酸產生的風味物質和CO2等，不僅對發酵乳制品的風味和組織狀態有重要影響，還具有潛在的益生作用[14]。

表1 微生物菌落形態及特性觀察

圖2 4株乳酸菌系統發育進化樹Fig.2 Phylogentic tree of four isolated strains based on 16S rDNA sequence

菌株MRSA1、MRSB1與EnterococcusfaeciumHY07 CP032308在同一分支上，且通過Bootstrap的驗證表明它們具有較高的置信度，支持率達到99%，因此可將MRSA1、MRSB1鑒定為屎腸球菌。

2.3 乳酸菌抑菌和抗氧化活性分析

2.3.1抑菌活性分析

菌株MRSA1、MRSA2、MRSB1、MRSD3在37 ℃發酵24 h后，發酵液pH值無顯著性差異(P>0.05)。對大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、李斯特菌、志賀氏菌、阪琦桿菌6株病原菌的抑菌實驗結果如圖3和表2。這4株乳酸菌對6株病原菌均有抑制作用，MRSA2的抑菌效果最強，對指示菌的抑菌效果顯著高于其余菌株 (P<0.05)，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、阪琦桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌均具有較強抑菌效果，抑菌圈直徑均在16 mm以上。菌株MRSA1對金黃色葡萄球菌有良好抑菌效果，MRSB1對阪琦桿菌和沙門氏菌有良好的抑菌效果，MRSD3對指示菌的抑菌效果較弱。這些菌株的不同抑菌效果，可能與其產生的不同抑菌物質有關。對發酵液用NaOH溶液調pH值至7，進一步分析抑菌活性，表明4株乳酸菌發酵液經堿中和后，對6株病原菌的抑菌活性全部消失，由此推測這4株乳酸菌的主要抑菌活性物質為酸性物質。

乳酸菌在發酵過程中能產生具有抑制腐敗菌的代謝產物，如有機酸、過氧化氫、細菌素和二乙酰等[15]。在中和處理酸性代謝產物后，大多數乳酸菌的抗菌活性喪失[16]。蘇本憲等[17]分析植物乳桿菌、瑞士乳桿菌、副干酪乳桿菌代謝產物對化膿性鏈球菌的抑制作用，發現主要抑菌物質為有機酸和H2O2。某些明串珠菌能夠產生抑菌成分，抑制發酵乳制品中有害菌的生長[18]。李東霞等[19]用牛津杯雙層法從蔬菜廢棄物中篩選出2株具有高抑菌活性的乳明串珠菌，其主要抑菌活性物質為酸性物質，與本研究結果一致。具有良好抑菌活性的明串珠菌可以抑制自然發酵食品中致病菌的生長，因此具有重要研究意義[20]。

1—MRSA1; 2—MRSA2; 3—MRSB1; 4—MRSD3。圖3 菌株抑菌活性測定Fig.3 Antibacterial activities of strains

菌株發酵液pH大腸桿菌金黃色葡萄球菌李斯特菌阪琦桿菌沙門氏菌志賀氏菌MRSA13.99±0.04+++++++MRSA23.84±0.06+++++++++++++++++MRSB13.85±0.05++++++++MRSD34.01±0.04++++++

抑菌圈直徑包含牛津杯外徑(7.8 mm)；+：抑菌圈直徑8.00～12.00 mm，抑菌效果較弱；++：12.00～16.00 mm，抑菌效果良好；+++：16.00～20.00 mm，抑菌效果較強。數值以平均值±標準差表示。

2.3.2抗氧化活性分析

實驗中細胞菌懸液經細胞破碎儀處理，菌株的破碎率達100%。4株乳酸菌的抗氧化活性測定結果如圖4，菌株對DPPH自由基和羥自由基均有不同程度的清除作用，且菌懸液的抗氧化能力高于無細胞提取物。菌株MRSA1和MRSA2的DPPH自由基清除能力顯著高于其他2株菌(P<0.05)，完整細胞菌懸液的清除能力顯著高于無細胞提取液(P<0.01)，因此初步推測乳酸菌清除DPPH自由基的活性物質主要存在于細胞表面。不同菌株之間羥自由基清除能力無顯著性差異(P>0.05)。

氧化作用是生物體內重要的生理過程，在此過程中會產生自由基，當自由基超過一定量時，就會對機體造成損傷[21]。乳酸菌的抗氧化活性已經通過體內和體外實驗證明，含有乳酸菌的功能性食品也越來越受到青睞[22]。不同乳酸菌的抗氧化能力存在差異，可能是由于菌株分泌的抗氧化活性物質種類和含量不同引起的[23]。劉宏宇等[24]研究了25株不同乳酸菌的抗氧化活性，發現腸膜明串珠菌的DPPH自由基清除能力最高可達30.73%，本研究的乳明串珠菌DPPH自由基清除能力高達60.67%。

DPPH-1、Hydroxyl-1表示細胞破碎前菌懸液，DPPH-2、Hydroxyl-2表示無細胞提取液。圖4 菌株對DPPH自由基和羥自由基的清除率Fig.4 DPPH and hydroxyl radical scavenging activities of selected strains

3 結 論

從4種市售宮廷奶酪中分離并經初篩和復篩得到4株乳酸菌，其中菌株MRSA1和MRSB1鑒定為屎腸球菌，MRSA2和MRSD3為乳明串珠菌。抑菌實驗結果表明，此4株乳酸菌均有抑菌活性，其中MRSA2對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、阪琦桿菌和志賀氏菌有較強抑制作用；而將發酵液pH值調至中性后，抑菌效果消失，推測抑菌活性物質為酸性物質?？寡趸钚詫嶒灲Y果表明，4株菌均對DPPH自由基和羥自由基具有清除能力，菌懸液的自由基清除率顯著高于無細胞提取液。菌株MRSA1和MRSA2的DPPH自由基清除能力分別高達55.04%和60.67%，4株菌的羥自由基清除能力無明顯區別。本研究篩選的具有良好抑菌特性、抗氧化活性和產酸能力的乳明串珠菌在功能性發酵食品中有潛在的應用前景。