超高壓輔助酶法脫除黃曲霉毒素B1工藝對米糠多肽品質的影響

林奕云， 林耀盛, 鄭家概， 林 晨， 付 強， 劉學銘

(1.中國廣州分析測試中心 廣東省分析測試技術公共實驗室， 廣東 廣州 510070;2.廣東省農業科學院 蠶業與農產品加工研究所/農業部功能食品重點實驗室/廣東省農產品加工重點實驗室, 廣東 廣州 510610)

米糠是稻米加工中的主要副產品，是糙米加工成白米過程中碾下的皮層以及少量米胚和碎米的混合物，約占稻谷質量的5%～5.5%[1]。米糠多肽是米糠蛋白經蛋白酶水解獲得的不同分子質量的多肽混合物，其氨基酸組成與FAO/WHO的建議模式接近，營養價值可與雞蛋蛋白媲美；具有易消化吸收，安全無毒，低過敏性等特點[2]。因此，以米糠為原料制備米糠多肽，對于提高米糠的附加值具有重要的現實意義。

米糠雖然有較高的利用價值，但由于其收獲、生產、加工、儲藏和銷售過程中易受黃曲霉和寄生曲霉等感染而產生黃曲霉毒素，導致米糠制品(如米糠多肽)中黃曲霉毒素殘留量較高，不能滿足國家限量標準的要求(≤10 μg/kg)。且目前大部分米糠仍作為動物飼料，甚至直接以廢物丟棄，造成資源的嚴重浪費。因此，制備米糠多肽的過程中有必要采取措施脫除黃曲霉毒素，生產出安全的米糠多肽。

傳統的多肽類物質制備多采用酶解法[3]，通常先采用“堿溶酸沉”工藝從米糠中提取蛋白質，再用蛋白酶對蛋白質進行水解制備多肽。經研究發現，以添加不同黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1，AFB1)初始濃度(20、40、60、80、100 μg/kg)染毒米糠為提取原料，以傳統酶法制備米糠肽中AFB1殘留量較高，脫除率只達到40.38%～48.69%，終產品米糠肽中AFB1在10 μg/kg以上，仍不能滿足國家限量標準[4]。由于米糠蛋白分子的聚合度較強，分子中存在較多的二硫鍵交聯，很難溶解[5]，導致米糠蛋白和多肽的提取得率低，單獨酶解法提取蛋白肽得率并不高，難以被利用，而Tang等[6]研究表明超高壓等物理法可以使細胞破碎而給酶催化提供合適的環境或者增加蛋白質溶解性，從而提高米糠蛋白及多肽的得率。

本文在酶法制備米糠肽的基礎上，經優化，以添加不同AFB1初始濃度提取出安全的米糠蛋白，再用胰蛋白酶在中性性環境下酶解，然后采用一定的超高壓和時間處理條件下，制備出安全米糠多肽，所制備的米糠多肽中AFB1殘留濃度均符合國標。正如Gomaa等[7]研究證明超高壓能引起極性分子振動從而對食品物料中黃曲霉毒素的有效脫除，本實驗在超高壓輔助酶法制備米糠肽工藝優化中，一方面，經過超高壓處理后，促進了米糠聚集物分散，糖基化而具有親水性，促進堿液與黃曲霉的接觸面積，加速黃曲霉的脫除作用，另一方面可能與在該處理過程中形成的糖基化產物有關，即蛋白質上糖鏈的引入，氫基的親水特性有助于蛋白質的溶解，但是脫除后其對米糠肽品質的影響仍有待進一步研究。

超高壓技術(ultra-high pressure，UHP)是指在高靜壓(一般為100～700 MPa)下進行處理，常以水或其他流體介質作為傳遞壓力的媒介，以改變物料某些理化特性的目的[8]。超高壓技術作為一種食品非熱加工技術，具有殺菌、保持食品原有營養成分、護色等特點，與傳統提取工藝比較，因高溫或高堿提取蛋白肽導致蛋白質變性甚至產生有毒物質而帶來的變化、損失及生理活性降低，超高壓技術具有不需要有機溶劑消耗，減少了對環境的污染，操作簡單等優點，目前在糧油加工中正逐步推廣應用[9-10]。本研究以米糠多肽的純度及回收率、多肽得率、水解度、溶解度、乳化性、起泡性、持水性、持油性等基本性質與功能特性作為檢測指標，評估超高壓輔助酶法脫除AFB1過程中超高壓處理對米糠多肽品質的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

米糠樣品：市售，研磨粉碎過80～100目篩，密封4 ℃冷藏。經測定，干基中蛋白質質量分數16.72%。AFB1標準品(純度>99.0%)，美國Alexis公司；胰蛋白酶，廣州市齊云生物技術有限公司。

1.2 實驗儀器

Milli-Q Integral 5型超純水系統，德國Merk Millpore公司；數顯電子天平、精密數顯pH計，廣州市深華生物技術有限公司；SB25-12 DTD型超聲波清洗機，寧波新芝生物科技股份有限公司；RLGY-600型自動超高壓儀，溫州貝諾機械有限公司；CR22GⅢ型高速冷凍離心機，日本HITACHL公司；SB-1100型水浴鍋，上海愛朗儀器有限公司；真空冷凍干燥機，美國Labconco公司；1200HPLC Agilent1260系列高效液相色譜儀配熒光檢測器，美國Agilent公司；K8400型蛋白質分析儀，瑞典FOSS ANALYTICALAB公司；UV-2450型紫外可見分光光度計，日本島津公司。

1.3 實驗方法

1.3.1超高壓輔助酶法制備無毒米糠多肽優化工藝

加標染毒米糠AFB1初始濃度分別為20、40、60、80、100 μg/kg，以1∶9.96的料液比(m(米糠)∶V(H2O)=1 g∶9.96 mL)加入超純水；用1 mol/L的NaOH溶液調節pH值至8.2，水浴45 ℃下攪拌并超聲60 min；用1 mol/L的HCl溶液調節pH值至4.5，酸沉；6 000 r/min離心15 min得沉淀；過濾沉淀水洗復溶，以1∶10料液比(m(溶液)∶V(NaOH溶液)=1g∶10 mL)加入0.08 mol/L NaOH水溶液復溶)，調節pH值至8.0，加胰蛋白酶酶解(加酶量質量分數1.5%)，pH=8.0，時間2.5 h，水浴溫度55 ℃，然后采用一定的超高壓分別對不同AFB1初始濃度的上述溶液處理0、1、3、5、7、9 min，90 ℃，10 min滅酶，冷卻至室溫；4 000 r/min離心5 min取上清液；冷凍干燥，得到米糠多肽制品。參考GB/T 5009. 22—2006方法，測定以上米糠多肽制品中AFB1殘留量(0.22、0.35、0.63、0.86和1.1 μg/kg)均符合國家標準的要求。

1.3.2超高壓處理

樣品采用聚乙烯塑料袋(13 cm×17 cm) 2層密封(不留頂隙)，進行超高壓處理。實驗采用100、200、300 MPa 3個壓力等級處理，保壓時間(1、3、5、7、9 min)。升壓用時約100 MPa/3 s，降壓用時約100 MPa/2 s。

1.3.3米糠多肽得率的測定

采用三氯乙酸(trichloroacetic acid，TCA)可溶性氮法[11]測定米糠多肽得率，多肽得率見式(1)。

ωtca-nsi=m1/m2×100%。

(1)

式(1)中，ωtca-nsi為三氯乙酸可溶性氮得率,即米糠多肽得率，%；m1為在φ=5%TCA中的可溶性氮質量,mg；m2為原料中的總氮質量，mg。

1.3.4米糠多肽功能特性及營養性質的測定

1.3.4.1 米糠多肽水解度的測定

采用pH-Stat 法測定米糠多肽水解度[12]，見式(2)。

DH=Vb×cb/(α×mP×htot)×100%。

(2)

式(2)中, DH為水解度，%；Vb為堿液體積,mL；cb為堿液濃度,mol/L；α為水解時α-氨基平均解離度；mp為底物中蛋白質質量,g；htot為底物中蛋白質的肽鍵總數,mmol/(g蛋白)，對于米糠多肽而言，1/α=2.26,htot=8.2。

1.3.4.2 米糠多肽溶解度的測定

采用Lowry法[13]測定米糠多肽溶解度。米糠多肽樣品研磨后過80目篩，以pH=7.0的0.05 mol/L磷酸二氫鉀-氫氧化鈉緩沖液配成10 g/L的濃度，25 ℃電磁攪拌1 h，6 000 r/min離心10 min，用Lowry法在分光光度計640 nm處測定上清液的OD值，先獲得牛血清白蛋白的標準曲線，再測定上清液中蛋白質含量。米糠多肽樣品總蛋白質含量使用微量凱氏定氮法測定。米糠多肽溶解度用氮溶解度指數NSI表示，見式(3)。

NSI=m上清液含氮/m樣品含氮×100%。

(3)

1.3.4.3 米糠多肽乳化性的測定

采用濁度法[14]測定米糠多肽乳化性。取1 g/L濃度的多肽溶液63 mL于250 mL燒杯中，加入27 mL大豆色拉油；用高速分散均質機在12 000 r/min轉速下分散2 min；用注射器從底部取0.1 mL乳狀液，迅速與1 g/L十二烷基磺酸鈉(sodium dodecyl sulfate, SDS)溶液5 mL混合均勻，在500 nm波長下比色，記錄吸光度(A0)；10 min后再從底部取0.1 mL乳狀液，同樣稀釋，比色，記錄吸光度(At)。多肽的乳化能力以乳化能力指數E0和乳化穩定性指數ESI表示，見式(4)。

ESI=A0×t/(A0-At)。

(4)

1.3.4.4 米糠多肽起泡性的測定

用0.05 moL/L磷酸二氫鉀-氫氧化鈉緩沖液(pH=7.0)配成1 g/L米糠多肽樣品，取100 mL用高速分散均質機在10 000 r/min轉速下分散2 min；轉入250 mL量筒，迅速記錄溶液與泡沫總體積V0，將上述體系靜置30 min后，測出下層析出液的體積Vt。米糠多肽起泡性和起泡穩定性見式(5)和(6)[15-16]。

起泡性=(V0-100)/100×100%。

(5)

起泡穩定性=Vt/V0×100%。

(6)

1.3.4.5 米糠多肽持水和持油能力的測定

米糠多肽持水性測定參考文獻[1]。準確稱取米糠多肽樣品m0于50 mL離心管中，加入10 mL去離子水，用漩渦混合器混勻，然后4 500 r/min離心15 min，傾去上清液，將離心管斜置30 min，稱重mt，見式(7)。

持水能力=(mt-m0)/m0。

(7)

米糠多肽持油性測定參考文獻[13]。準確稱取米糠多肽樣品m0于50 mL離心管中，加入5 mL大豆色拉油，用漩渦混合器混勻，然后4 500 r/min離心15 min，吸去上層未吸附油，稱重mt，見式(8)。

持油能力=(mt-m0)/m0。

(8)

1.4 數據處理

實驗重復3次，采用OriginPro 8.5繪圖和SPSS 11.0進行ANOVA方差分析(Tukey分析均值差異的顯著性，顯著水平P≤0.05)。

2 結果與分析

2.1 超高壓對米糠多肽得率的影響

在不同超高壓壓力和時間處理下，考察米糠多肽得率的變化見圖1和圖2。

圖1 超高壓處理壓強對米糠多肽得率的影響Fig.1 Effect of ultra high pressure treatment on purity of rice bran polypeptides

圖2 超高壓處理時間對米糠多肽得率的影響Fig.2 Effect of ultra high pressure treatment time on yiled of rice bran polypeptides

由圖1和圖2可知，在0～5 min隨著超高壓處理時間的延長，米糠多肽的得率逐漸增大，處理時間5 min時米糠多肽的得率最大，但隨著超高壓處理時間的進一步延長，其多肽得率呈平穩趨勢。這可能是Tang等[6]研究表明因為超高壓使細胞破碎誘導米糠蛋白質分子產生極化現象，維持蛋白分子空間結構的非共價鍵被破壞，分子柔性提高，肽鍵暴露，為胰蛋白酶提供更多酶切位點，因此多肽得率提高。另外，超高壓處理也能提高蛋白質酶活性，Kim等[17]以胰蛋白酶為材料，胰蛋白酶具有由組氨酸-57、天冬氨酸-102和絲氨酸-195組成的催化三聯體，分別以100、300 MPa的壓力處理比較分析，胰蛋白酶活性增強，主要在于酰基-酶中間體的催化三聯體在高壓下不被破壞，反而因壓力的作用使蛋白質內腔壓縮導致酶作用部位堆積，更有效地增強酶催化作用。但是，隨著超高壓處理時間的進一步延長，蛋白質分子進一步展開，極化的蛋白質分子之間相互吸引，通過非共價鍵重新形成大分子聚集體，分子柔性降低，表面肽鍵數減少，為胰蛋白酶提供的酶切位點減少，所以多肽得率降低。

2.2 超高壓對米糠多肽水解度的影響

實驗采用300 MPa超高壓，在不同時間處理條件下，考察米糠多肽水解度的變化，見圖3。

圖3 超高壓處理時間對米糠多肽水解度的影響Fig.3 Effect of ultra high pressure treatment time on degree of hydrolysis of rice bran polypeptides

由圖3可知，在0～5 min隨著超高壓處理時間的延長，米糠多肽的水解度逐漸增強，處理時間5 min時米糠多肽的水解度最強，但隨著超高壓處理時間的進一步延長，其水解度呈下降趨勢。這與Zhang等[18]研究超高壓結合酶解對鷹嘴豆分離蛋白水解度的影響及其水解物的抗氧化活性時的結果相一致，在300 MPa高壓條件下，胰蛋白酶的活性隨著時間的增加而增大，其水解度隨著增大，維持蛋白質分子空間結構的非共價鍵被破壞，分子柔性提高，肽鍵暴露，因此水解度增加。類似研究王章存等[19]采用200～400 MPa的超高壓處理使蛋白酶酶解的水解度提高，同時加快了酶解的速度；研究發現適當的壓力處理可以改變蛋白質的結構使其緊密的結構伸展或松散、暴露出分子內部的酶作用位點，利于酶解的進行。Tang等[6]研究表明超高壓等物理法可以使細胞破碎而給酶催化提供合適的環境或者增加蛋白質溶解性，從而提高米糠蛋白和多肽的得率。但是，隨著超高壓處理時間的進一步延長，蛋白質分子進一步展開，極化的蛋白質分子之間相互吸引，通過非共價鍵重新形成大分子聚集體，分子柔性降低，表面肽鍵數減少，所以水解度降低。

2.3 超高壓對米糠多肽溶解度的影響

溶解度是蛋白質及多肽的基本物理性質之一，主要與蛋白質分子表面電荷有關[20]。本實驗采用300 MPa超高壓，在不同處理時間條件下，考察米糠多肽溶解度的變化，見圖4。

圖4 超高壓處理時間對米糠多肽溶解度的影響Fig.4 Effect of ultra high pressure treatment time on solubility of rice bran polypeptides

在超高壓作用下，蛋白質極性分子與水分子變成有序極性分子并且發生高速的振蕩、碰撞、摩擦和擠壓作用，產生巨大的熱量，引起蛋白質等極性分子基團電性質變化，從而使蛋白質功能性質發生變化。如圖4可知，相比酶法制備米糠多肽，隨著超高壓處理時間的增加，米糠多肽的溶解性顯著增強，當超高壓處理時間超過5 min后米糠多肽的溶解性明顯下降。這是因為多肽的溶解性與其表面疏水與親水作用有很大的關聯。由于超高壓作用下，多肽分子之間發生了交聯，多肽小分子聚集成大分子，而且交聯部位很可能集中于疏水基團，以至于米糠多肽親水性提高，溶解性提高。隨著超高壓時間的延長，作用力使多肽的球形結構變為棒狀結構，疏水基團暴露，疏水殘基相互作用形成網絡，又會使蛋白質的溶解性降低[21]。

2.4 超高壓對米糠多肽乳化性的影響

乳化性是蛋白肽的重要功能之一，是指蛋白肽將油和水結合形成油水乳狀液保持穩定的能力，具體包括乳化性和乳化穩定性2個方面。本實驗采用300 MPa超高壓，在不同處理時間條件下，考察米糠多肽乳化性的變化，見圖5。

圖5 不同超高壓處理時間對米糠多肽乳化性的影響Fig.5 Effect of ultra high pressure treatment time on emulsification capacity of rice bran polypeptides

圖6 超高壓處理時間對米糠多肽泡沫性的影響Fig.6 Effect of ultra high pressure treatment time on foam capacity of rice bran polypeptides

由圖5可知，在0～3 min隨著超高壓處理時間的延長，米糠多肽的乳化性和乳化穩定性逐漸增強，處理時間3 min時米糠多肽的乳化性和乳化穩定性最強，但隨著超高壓處理時間的進一步延長，其乳化性和乳化穩定性呈下降趨勢。這是因為超高壓作用力使米糠多肽分子產生極化現象，維持多肽分子空間結構的非共價鍵被破壞，分子柔性提高，更多的分子結合到油-水界面；同時，多肽分子內部的疏水殘基暴露在蛋白質表面，其表面疏水性增強，故米糠多肽的乳化性和乳化穩定性增強。在300 MPa壓力下，水解度隨處理時間的延長先增大后減小，在水解度3 min時最大時，乳化性反而降低。這與管軍軍等[22]研究大豆蛋白的乳化性時也有相似的結果，隨著水解度的增大，大豆蛋白的乳化穩定性先上升后下降，這是因為：水解度過大時，隨著超高壓作用力處理時間的進一步延長，多肽分子進一步展開，會破壞多肽分子中疏水區域的結構，導致疏水區域比例相對減小，所以其乳化性和乳化穩定性呈下降趨勢。

2.5 超高壓對米糠多肽起泡性的影響

起泡性是指蛋白肽攪打起泡的能力，而起泡穩定性則是泡沫保持穩定的能力。本實驗采用300 MPa超高壓，在不同處理時間條件下，考察米糠多肽起泡性的變化，見圖6。

劉國琴等[23]采用300 MPa的壓力處理大豆分離蛋白，發現超高壓處理可以增加蛋白質的起泡性。由圖6可知，超高壓輔助處理可提高米糠多肽起泡性，但是隨著超高壓處理時間的延長，其起泡穩定性先提高后下降。超高壓作用下米糠多肽分子產生極化現象，非共價鍵被破壞，多肽分子部展開，其內部的疏水殘基暴露在多肽表面，促進多肽分子之間相互作用和水—空氣界面的形成，形成更穩定的二維網絡結構和界面膜，故起泡性和起泡穩定性增強。隨著超高壓處理時間的進一步延長，多肽分子進一步展開，其內部的疏水基團和巰基進一步暴露，極化的多肽分子之間通過非共價鍵重新形成分子聚集體，水-空氣界面膜的穩定性下降，因此，起泡穩定性呈下降趨勢。

2.6 超高壓對米糠多肽持水性、持油性的影響

食品加工中蛋白質主要影響食品的口感和風味，蛋白質的持水性能主要影響食品的質地和口感，持油性能影響油脂保留能力，與食品風味密切相關，因此持水性、持油性是食品工過程中非常重要的指標。本實驗采用300 MPa超高壓，在不同處理時間條件下，考察米糠多肽起泡性的變化，見圖7。

由圖7可知，超高壓處理可明顯降低米糠蛋白肽的持水能力，但可提高米糠多肽的持油能力。超高壓技術是一種非熱加工技術，使得具有操作溫度低的優勢，有利于保持油脂原有的品質[16,24]。使米糠多肽變性進而聚集成大分子聚合體，從而減少米糠多肽的比表面積和極性基團與水的有效結合，使得米糠多肽的水合能力因多肽間相互作用的增強而降低，反之，卻提高了米糠多肽的持油能力。

圖7 超高壓處理時間對米糠短肽持油性和持油性的影響Fig.7 Effect of ultra high pressure treatment time on water retention and oil holding capacity of rice bran polypeptides

3 結 論

研究表明在超高壓300 MPa條件下，隨著超高壓處理時間(0、1、3、5、7、9 min)的延長，超高壓輔助酶法制備無毒米糠多肽的多肽得率、水解度、溶解性、起泡穩定性、乳化性和乳化穩定性先提高后下降；起泡性和持油性顯著提高；而持水性呈下降趨勢。由此可得出結論：在確保米糠多肽安全無毒的前提下，超高壓輔助酶法降解AFB1優化工藝對米糠多肽品質有一定的影響，并且總體上呈現較好的趨勢，但該超高壓工藝對米糠多肽分子結構和活性的影響機制尚不完全明確，超高壓對蛋白肽活性區域和多聚體蛋白結合區域分子結構的影響仍需進一步研究。