不同β-葡萄糖苷酶性能分析及對(duì)羅漢果苷的轉(zhuǎn)化

李登科, 王欣馳, 陳雪佳, 李家霖, 胡小妍, 路福平， 李 玉

(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院/工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 天津 300457)

羅漢果苷為羅漢果中研究最多的活性成分，具有消炎、止咳、護(hù)肝、降糖、抗疲勞、增強(qiáng)免疫等顯著功能[1]。1983年，日本人竹本首次采用光譜和化學(xué)分析法鑒定了羅漢果醇及其甙的結(jié)構(gòu)[2]，之后陸續(xù)分離和鑒定出30多種甜味化合物羅漢果苷[3-4]。羅漢果苷V是成熟的羅漢果的主要成分，其甜度是蔗糖的250～400倍，在人體代謝過(guò)程中不需要胰島素的參與[5]，是肥胖以及糖尿病等不宜攝糖人群理想的糖替代品[6]。由于這些羅漢果苷均為葫蘆烷型四環(huán)三萜類的衍生物，區(qū)別在于R1和R2兩處所鏈接的葡萄糖基不同，因此結(jié)構(gòu)上的相似性對(duì)其分離純化造成了一定的干擾[7]，加之羅漢果醇、羅漢果苷ⅢE、羅漢果苷ⅡE等在羅漢果中的含量少，導(dǎo)致其價(jià)格偏高，對(duì)其功能的深入研究也少有報(bào)道[8]。因此實(shí)現(xiàn)羅漢果苷的定向轉(zhuǎn)化，生成特定的羅漢果苷及其類似物，為進(jìn)一步探究其作用機(jī)制提供原料具有重要意義。

目前，羅漢果苷的獲得主要通過(guò)從原料中直接提取、化學(xué)合成和酶法合成等方法[9]。從羅漢果中提取的羅漢果苷是市場(chǎng)上最常見的產(chǎn)品，但此類產(chǎn)品加工技術(shù)過(guò)于粗糙，技術(shù)指標(biāo)也較為廣泛，可信值大大降低。微生物酶法轉(zhuǎn)化具有反應(yīng)條件溫和、專一性強(qiáng)、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)[10]。β-葡萄糖苷酶可水解結(jié)合于末端的非還原性的β-D-葡萄糖苷鍵，釋放出葡萄糖和相應(yīng)的配基[11]。由于β-葡萄糖苷酶廣泛的底物特異性，可作用于β-(1,1)、β-(1,2)、β-(1,3)、β-(1,4)和β-(1,6)糖苷鍵[12]，有的β-葡萄糖苷酶還具有轉(zhuǎn)移葡萄糖基的作用[13]，因此可利用不同來(lái)源β-葡萄糖苷酶的底物特異性來(lái)進(jìn)行羅漢果苷的轉(zhuǎn)化，提高稀有結(jié)構(gòu)羅漢果苷的含量，為羅漢果苷的功能研究奠定基礎(chǔ)[14]。本研究擬利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)對(duì)不同來(lái)源的β-葡萄糖苷酶進(jìn)行異源表達(dá)，并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行分析，初步確定轉(zhuǎn)化的最佳條件。以羅漢果苷Ⅴ為底物進(jìn)行酶法轉(zhuǎn)化，探究酶水解性能的差異和特異性，希望為酶法制備羅漢果苷及其結(jié)構(gòu)類似物提供新的來(lái)源和途徑。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

大腸桿菌JM109、畢赤酵母GS115、黑曲霉TCCC 41063和表達(dá)載體pPIC9K均為天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院菌種保藏中心保藏。酵母粉、蛋白胨，購(gòu)于Oxoid公司；質(zhì)粒抽提試劑盒、DNA純化試劑盒等，購(gòu)于美國(guó)Omega公司；標(biāo)準(zhǔn)品羅漢果苷ⅢE、Ⅳ、Ⅴ，購(gòu)于成都普瑞發(fā)科技開發(fā)有限公司。其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器

Bio電擊轉(zhuǎn)化儀和S1000型PCR型基因擴(kuò)增儀，美國(guó)Bio-Rad公司；MaxQ6000型恒溫調(diào)速搖床，美國(guó)Thermo Scientific公司；TU-1810型紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；Milli-Q型超純水系統(tǒng)，天津市奧佳科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1重組菌株的構(gòu)建

將不同來(lái)源的β-葡萄糖苷酶基因進(jìn)行合成或采用PCR技術(shù)從實(shí)驗(yàn)室保藏菌種中擴(kuò)增，得到目的基因。其中來(lái)源于特異腐質(zhì)霉Humicolainsolens的β-葡萄糖苷酶基因(bglHi)，來(lái)源于棘孢曲霉Aspergillusaculeatus的β-葡萄糖苷酶基因(bglAa)，由蘇州金唯智生物科技有限公司優(yōu)化合成。黑曲霉Aspergillusniger來(lái)源的β-葡萄糖苷酶基因(bglAn)通過(guò)PCR擴(kuò)增得到，其引物序列為：F：CGCGAATTCGCTGATGAATTGGCCTAC；R：CTAGCGGCCGCTTAGTGAACAGTAGGCAG。將目的基因與載體pPIC9K連接構(gòu)建重組質(zhì)粒，化轉(zhuǎn)至大腸桿菌JM109。將構(gòu)建正確的重組質(zhì)粒線性化后電轉(zhuǎn)至畢赤酵母GS115中，經(jīng)G418篩選后，通過(guò)PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)化子。

1.3.2β-葡萄糖苷酶的誘導(dǎo)表達(dá)

將重組菌株的單菌落分別接到30 mL YPG培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min培養(yǎng)16～18 h；按2%接種量分別將種子液接入50 mL BMGY液體培養(yǎng)基中，30 ℃，180 r/min培養(yǎng)至OD600達(dá)到5～6(約16～20 h)；收集菌液于滅菌的50 mL離心管中，8 000r/min，離心5 min，倒掉上清液，用20 mL BMMY培養(yǎng)基重懸菌體進(jìn)行細(xì)胞洗滌，重復(fù)洗滌3次，最后用BMMY培養(yǎng)基重懸菌體(菌體終濃度OD600為1)；饑餓1 h后開始添加誘導(dǎo)劑甲醇，每隔24 h加入0.5%甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，并定時(shí)取樣分析。

1.3.3β-葡萄糖苷酶活力的檢測(cè)

以對(duì)硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)為底物，檢測(cè)β-葡萄糖苷酶的酶活力。pNPG的水解產(chǎn)物為對(duì)硝基苯(pNP)和葡萄糖，pNP在400 nm下有特異的吸光值，可以進(jìn)行比色測(cè)定。將反應(yīng)體系中每分鐘產(chǎn)生1 μmol pNP所需的酶量定義為1個(gè)酶活力單位(U)。

繪制pNP的標(biāo)準(zhǔn)曲線：配制0.1 mg/mL對(duì)硝基苯酚母液，分別稀釋到質(zhì)量濃度為0.002、0.004、0.006、0.008、0.010 mg/mL。以無(wú)菌水為空白，在400 nm下測(cè)定吸光度值。以O(shè)D600值為縱坐標(biāo)，pNP質(zhì)量濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，做出pNP的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4不同來(lái)源β-葡萄糖苷酶酶學(xué)性質(zhì)的分析

為了考察酶的最適溫度、熱穩(wěn)定性、最適pH值和酸堿穩(wěn)定性，按照1.3.3的方法在不同的溫度(30、40、50、55、60、65、70、75、80 ℃)和pH(3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0)下測(cè)定酶的活力。將最高酶活力設(shè)為100%，計(jì)算各條件下的相對(duì)酶活力，以確定酶的最適溫度和pH值。將酶置于酶的最適反應(yīng)溫度附近，恒溫水浴處理10 h,每隔1 h測(cè)量酶的殘留活力，以確定酶的熱穩(wěn)定性。將酶適當(dāng)稀釋于pH值為3.0～8.0的緩沖體系中，置于4 ℃冰箱保存12 h，在不同pH值條件下測(cè)量酶的殘留活力，以確定酶的酸堿穩(wěn)定性。

1.3.5不同來(lái)源β-葡萄糖苷酶水解羅漢果苷Ⅴ底物特異性分析

在酶的最適反應(yīng)條件下，向10 mL的反應(yīng)體系中加入2 U不同來(lái)源的β-葡萄糖苷酶(以100 ℃煮沸10 min的滅活發(fā)酵液上清液作為對(duì)照)，以質(zhì)量濃度為1 mg/mL和5 mg/mL的羅漢果苷Ⅴ(40%)作為底物進(jìn)行反應(yīng)，定點(diǎn)取樣。繪制標(biāo)準(zhǔn)品羅漢果ⅢE標(biāo)準(zhǔn)曲線：配制1 mg/mL羅漢果ⅢE母液，分別稀釋至質(zhì)量濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL；以峰面積為縱坐標(biāo)，羅漢果ⅢE的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

HPLC檢測(cè)條件：色譜柱為ZORBAX SB-Aq 4.6 mm×150 mm×5 μm；柱溫為30 ℃；流動(dòng)相為水(A相)和乙腈(B相)；梯度洗脫程序?yàn)?～3 min 20%B，3～8 min 30%B，8～9 min 35%B；流速為0.8 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同來(lái)源β-葡萄糖苷酶的克隆表達(dá)結(jié)果

2.1.1表達(dá)載體pPIPC9K-bgl的構(gòu)建結(jié)果

將特異腐質(zhì)霉、棘孢曲霉和黑曲霉來(lái)源的β-葡萄糖苷酶基因bglHi、bglAa和bglAn雙酶切后，與相同酶切后的載體pPIC9K片段相連，化轉(zhuǎn)至大腸桿菌JM109中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pPIC9K-bglHi、pPIC9K-bglAa和pPIC9K-bglAn。用對(duì)應(yīng)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切鑒定，結(jié)果如圖1。泳道1顯示，在約1 400 bp和9 300 bp位置分別出現(xiàn)兩條電泳條帶，與基因bglHi(1 443 bp)和載體(9 276 bp)的大小一致；泳道2和3顯示出的約2 600 bp的條帶分別與基因bglAa(2 597 bp)和bglAn(2 583 bp)的大小一致，說(shuō)明目的基因已成功插入到載體中。

圖2 重組轉(zhuǎn)化子的高拷貝篩選Fig.2 High copies screening of recombinant strains

泳道1: pPIC9K-bglHi；泳道2: pPIC9K-bglAa；泳道3：pPIC9K-bglAn；M: 1kb DNA ladder。圖1 重組質(zhì)粒pPIC9K-bgl的雙酶切鑒定結(jié)果Fig.1 Identification of there combinant plasmids by double enzymes digestion

2.1.2重組畢赤酵母菌株GS115/pPIPC9K-bgl的篩選鑒定結(jié)果

分別提取構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒pPIC9K-bglHi、pPIC9K-bglAa和pPIC9K-bglAn，用SacI線性化，電轉(zhuǎn)至畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于MD營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選板，30 ℃下培養(yǎng)2～3 d，至有單菌落產(chǎn)生。挑取重組畢赤酵母轉(zhuǎn)化子分別接種于質(zhì)量濃度為0.5、1.0、2.0 mg/mL的YPD/G418抗性篩選平板上，進(jìn)行抗性復(fù)篩，挑取在高濃度G418下生長(zhǎng)狀態(tài)良好的單菌落，進(jìn)行驗(yàn)證和誘導(dǎo)表達(dá)，重組菌株分別命名為P.pastoris/pPIC9K-bglHi，P.pastoris/pPIC9K-bglAa，P.pastoris/pPIC9K-bglAn。以P.pastoris/pPIC9K-bglHi為例，圖2表明了重組菌株在不同濃度G418下的生長(zhǎng)情況。挑取在G418質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL的YPD平板上菌落形態(tài)最大的單克隆，作為下一步的研究對(duì)象。

2.1.3不同來(lái)源β-葡萄糖苷酶的表達(dá)及酶活性分析結(jié)果

按照1.3.2的方法進(jìn)行酶的誘導(dǎo)表達(dá)，發(fā)酵結(jié)束后離心取上清液，獲得粗酶液。3種不同來(lái)源的酶分別命名為BglHi，BglAa和BglAn，利用12%SDS-PAGE分析酶的表達(dá)情況，結(jié)果如圖3。泳道1為對(duì)照菌株GS115/pPIC9K的發(fā)酵上清液，泳道2為P.pastoris/pPIC9K-bglHi的發(fā)酵上清液，與泳道1相比，可見明顯的蛋白條帶，其表觀分子質(zhì)量約為60 kDa。泳道3和4分別為P.pastoris/pPIC9K-bglAa和P.pastoris/pPIC9K-bglAn的發(fā)酵上清液，蛋白質(zhì)的表觀分子質(zhì)量約為135 kDa和120 kDa。采用軟件DNAman對(duì)不同來(lái)源β-葡萄糖苷酶的氨基酸序列進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)其理論分子質(zhì)量，結(jié)果顯示：BglHi、BglAa和BglAn的理論分子質(zhì)量分別為54.05、93.05 kDa和93.25 kDa，其理論分子質(zhì)量均小于表觀分子質(zhì)量，這與畢赤酵母在表達(dá)分泌目標(biāo)蛋白時(shí)會(huì)對(duì)其進(jìn)行糖基化修飾有關(guān)[15-16]。按照1.3.3的方法，繪制pNP的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖4，其線性回歸方程為Y=39.43X-0.020 3；R2=0.998 9。以pNPG為底物，在pH值6.0、溫度50 ℃的條件下，反應(yīng)5 min，測(cè)得BglHi，BglAa和BglAn三種酶的酶活力分別為25.97、40.69、90.83 U/mg。

泳道1：P. pastoris/pPIC9K對(duì)照；泳道2：P. pastoris/pPIC9K-bglHi的發(fā)酵上清液；泳道3：P. pastoris/pPIC9K-bglAa的發(fā)酵上清液；泳道4：P. pastoris/pPIC9K-bglAn的發(fā)酵上清液；M：蛋白Marker。圖3 重組畢赤酵母發(fā)酵上清液的SDS-PAGE分析結(jié)果Fig.3 SDS-PAGE analysis of recombinant β-glucosidase expressed in P. pastoris GS115

圖4 pNP標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard curve of pNP

酶活力計(jì)算公式見式(1)。

(1)

式(1)中，S：樣品的酶活力，U/mL；X：pNP質(zhì)量濃度，mg/mL；V1：反應(yīng)液體積，mL；V2：酶液的體積，mL；t：反應(yīng)時(shí)間，min；n：稀釋倍數(shù)。

2.2 不同來(lái)源β-葡萄糖苷酶性質(zhì)的測(cè)定結(jié)果

2.2.1溫度對(duì)酶活力的影響

溫度是影響酶催化反應(yīng)的重要因素，為確定溫度對(duì)不同來(lái)源β-葡萄糖苷酶的影響，按照1.3.4的方法測(cè)定了不同溫度下β-葡萄糖苷酶的相對(duì)活力，以及在50、60、70 ℃下處理10 h后酶的相對(duì)活力隨時(shí)間的變化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5、圖6。由圖5可以看出，BglHi、BglAn和BglAa的最適溫度分別為55、60 ℃和65 ℃。由圖6可知，這3種酶均能在50 ℃時(shí)維持較好的穩(wěn)定性，在50 ℃下處理10 h均可保持50%以上的相對(duì)酶活性，而在60 ℃和70 ℃時(shí)其穩(wěn)定性欠佳。

圖5 不同來(lái)源β-葡萄糖苷酶的最適溫度Fig.5 Optimum temperatures of different β-glucosidase

2.2.2pH值對(duì)酶活力的影響

圖6 不同來(lái)源β-葡萄糖苷酶的熱穩(wěn)定性Fig.6 Thermo stability of different β-glucosidases

為了探究pH值對(duì)酶活力的影響，測(cè)定了不同pH值時(shí)酶的相對(duì)活力和在不同pH值時(shí)處理12 h后酶殘余活力的相對(duì)值，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7。圖7中，BglHi、BglAn和BglAa的最適pH值分別為6.0、5.5和5.0，與Yan等[17]的研究結(jié)果一致。這一結(jié)果在一定程度上表明，β-葡萄糖苷酶多為酸性酶，而這一特性有利于其在食品飲品加工及纖維素水解等過(guò)程中應(yīng)用，因?yàn)樵撨^(guò)程多發(fā)生在pH值為4.0～6.0[18]時(shí)。圖8顯示了酶的酸堿穩(wěn)定性，其中BglHi和BglAa的酸堿穩(wěn)定性較好。在pH值為4.0～8.0的緩沖液下處理12 h，均可殘留60%以上的酶活力，但BglAn在pH值為3.0～4.0時(shí)穩(wěn)定性較差。

圖7 不同來(lái)源β-葡萄糖苷酶的最適pH值Fig.7 Optimum pH value of different β-glucosidases

圖8 不同來(lái)源β-葡萄糖苷酶的酸堿穩(wěn)定性Fig.8 pH stability of different β-glucosidases

2.3 不同來(lái)源β-葡萄糖苷酶對(duì)羅漢果苷轉(zhuǎn)化性能的比較

按照1.3.5的HPLC檢測(cè)條件，繪制出羅漢果ⅢE的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖9，其線性回歸方程為Y=2 806.2X+90.109；R2=0.999 2。檢測(cè)了BglHi、BglAa、BglAn在以1 mg/mL和5 mg/mL的羅漢果苷Ⅴ(40%)為底物時(shí)的轉(zhuǎn)化情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖10。以1 mg/mL的羅漢果苷Ⅴ(40%)為底物，在反應(yīng)20 min時(shí)，均有轉(zhuǎn)化產(chǎn)物羅漢果ⅢE的生成。BglHi和BglAa轉(zhuǎn)化率分別為5.1%和6.37%。延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間至12 h，未見其水解產(chǎn)物羅漢果ⅢE增多；然而BglAn將底物幾乎完全轉(zhuǎn)化為羅漢果ⅢE，轉(zhuǎn)化率為96.5%，如圖10(c)所示。增加底物羅漢果Ⅴ濃度，以5 mg/mL的羅漢果苷Ⅴ(40%)為底物，在反應(yīng)30 min時(shí)，BglHi和BglAa轉(zhuǎn)化率分別為6.23%和6.89%，延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間至12 h，未見其水解產(chǎn)物羅漢果ⅢE增多；而BglAn在1 h內(nèi)隨反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，產(chǎn)物羅漢果苷ⅢE明顯增多，轉(zhuǎn)化率依次為17.77% (5 min)、68.6% (30 min)、97.9% (1 h)，如圖10 (d～f) 所示。此結(jié)果可以證明，BglAn對(duì)羅漢果苷Ⅴ結(jié)構(gòu)中3位和24位的β-1，6-糖苷鍵的專一水解性極強(qiáng)，可以有效地轉(zhuǎn)化生成羅漢果苷ⅢE。

圖9 羅漢果ⅢE標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.9 Standard curve of mogroside ⅢE

(a)羅漢果苷Ⅴ(6.068 min)、Ⅳ(6.735 min)、ⅧE(7.435 min)；(c)BglAn轉(zhuǎn)化1 mg/mL羅漢果苷Ⅴ； (d) (e) (f) BglAn轉(zhuǎn)化5 mg/ml羅漢果苷Ⅴ。圖10 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的HPLC分析結(jié)果Fig.10 HPLC analysis of transformation products

3 結(jié) 論

利用畢赤酵母GS115表達(dá)系統(tǒng)對(duì)來(lái)源于特異腐質(zhì)霉、棘孢曲霉和黑曲霉的β-葡萄糖苷酶基因bglHi、bglAa和bglAn進(jìn)行了異源表達(dá)。對(duì)不同來(lái)源的β-葡萄糖苷酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究。比較發(fā)現(xiàn)，3種來(lái)源的酶最適溫度均在55～65 ℃，并且在50 ℃下的穩(wěn)定性均能保持在50%以上；3種酶的最適pH值范圍在5.0～6.0，同時(shí)酸堿穩(wěn)定性都能保持在80%以上。以羅漢果苷Ⅴ為底物，通過(guò)對(duì)不同來(lái)源β-葡萄糖苷酶轉(zhuǎn)化性能的比較，發(fā)現(xiàn)來(lái)源于黑曲霉的β-葡萄糖苷酶BglAn在底物質(zhì)量濃度為1 mg/mL時(shí)，20 min就可以將羅漢果苷Ⅴ幾乎全部轉(zhuǎn)化為羅漢果苷ⅢE，轉(zhuǎn)化率為96.5%；將底物濃度由1 mg/mL提高到5 mg/mL，60 min時(shí)，轉(zhuǎn)化率高達(dá)97.9%。另外兩種來(lái)源的β-葡萄糖苷酶BglHi和BglAa，僅能轉(zhuǎn)化生成少量的羅漢果苷ⅢE，轉(zhuǎn)化率為5%～7%。由此可以證明：來(lái)源于黑曲霉的β-葡萄糖苷酶BglAn對(duì)羅漢果苷Ⅴ結(jié)構(gòu)中3位和24位的β-1，6-糖苷鍵有極高的專一水解性，并且轉(zhuǎn)化率極高，基本實(shí)現(xiàn)完全轉(zhuǎn)化，這極大地降低了羅漢果苷ⅢE后期分離和純化的難度，為實(shí)現(xiàn)羅漢果苷類物質(zhì)的工業(yè)化生產(chǎn)提供了可能。