新疆某牛場(chǎng)不同日齡犢牛糞源大腸桿菌耐藥性分析

哈力亞爾·吾布力 ,迪力穆拉提·玉蘇普 ,米克熱木·沙衣布扎提 ,買占海 ,蘇占強(qiáng) ,劉英玉 ,張曉紅,姚 剛,夏利寧,張小鶯,吾買爾江·牙合甫,賽福丁·阿不拉

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,新疆烏魯木齊830052 ;2.新疆醫(yī)科大學(xué),新疆烏魯木齊 830054)

食品安全目前是每個(gè)人最關(guān)注的熱點(diǎn)問題之一,日常生活中絕對(duì)離不開畜產(chǎn)品,包括雞、鴨、牛、羊肉等。隨著畜產(chǎn)品的發(fā)展,畜產(chǎn)品中出現(xiàn)的問題越來越多,2017 年3 月15 日“315 國(guó)際消費(fèi)者權(quán)益日”報(bào)道少數(shù)養(yǎng)殖場(chǎng)在動(dòng)物飼料中添加抗生素類等不符合食品安全的藥物,而這種行為的背后存在著巨大的食品安全隱患-抗生素耐藥性,某些抗生素在家畜養(yǎng)殖過程中雖能起到促生長(zhǎng)促增肉作用,但產(chǎn)生的耐藥性作用無法挽回,最終通過食物鏈引起人類產(chǎn)生抗生素耐藥性。

大腸埃希氏菌(Escherichia coli.,E.coli)通常被稱為大腸桿菌,屬于大腸桿菌科、埃希氏菌屬,是動(dòng)物腸道發(fā)現(xiàn)的共生細(xì)菌和機(jī)會(huì)性病原體[1]。牛大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌引起患牛的急性傳染病[2]。主要表現(xiàn)腸炎、腸毒血癥等多種臨床癥狀。不同時(shí)期感染所表現(xiàn)的臨床癥狀不同,所以該病可分為犢牛黃痢、犢牛白痢和牛水腫病3 種[3]。為控制大腸桿菌引起的疾病多采用抗菌藥物進(jìn)行治療,但由于濫用抗菌藥物導(dǎo)致的細(xì)菌耐藥性成為全球性問題,被世界衛(wèi)生組織定義為21 世紀(jì)最大的公共衛(wèi)生安全問題之一[4-5]。由耐藥性致病菌引起動(dòng)物感染的疾病治療變得更加困難,造成經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。人類的細(xì)菌性疾病多也采用抗生素進(jìn)行治療,而人與動(dòng)物的抗菌藥物種類在一定程度是相似的,很多抗生素使用只是劑量大小的差異。目前有證據(jù)表明,動(dòng)物在使用抗生素藥物產(chǎn)生的耐藥性,可經(jīng)傳遞進(jìn)入人體,造成人類病原菌耐藥現(xiàn)象的出現(xiàn),對(duì)人類疾病治療產(chǎn)生不良影響[6-7]。

本試驗(yàn)通過對(duì)新疆某牛場(chǎng)犢牛不同生長(zhǎng)期的牛糞源大腸桿菌進(jìn)行臨床常用抗菌藥物的耐藥性調(diào)查,掌握不同犢牛不同生長(zhǎng)期牛攜帶大腸桿菌的耐藥情況;監(jiān)測(cè)牛群大腸桿菌耐藥性的發(fā)展變化動(dòng)態(tài),有利于掌握動(dòng)物源耐藥菌的擴(kuò)散,獲取耐藥性數(shù)據(jù),指導(dǎo)養(yǎng)殖場(chǎng)合理臨床用藥提供科學(xué)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集 2016 年12 月在新疆某肉牛場(chǎng)出生1 -3 月不同日齡犢牛進(jìn)行樣品采集,利用肛拭子在直腸采集新鮮犢牛源糞200 份。

1.2 試驗(yàn)藥品及培養(yǎng)基 麥康凱培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯、瓊脂、Mueller -Hinton(MH)、乳糖、蛋白胨、溴甲酚紫水溶液、氫氧化鈉等,均購自北京奧博星生物技術(shù)有限公司;藥敏片阿莫西林(AMC)、阿莫西林/克拉維酸鉀(APC)、環(huán)丙沙星(CIP)、恩諾沙星(ENR)、諾氟沙星(NOR)、氨芐西林(AMP)、慶大霉素(GEN)、阿米卡星(AMI)等,均購自杭州微生物試劑有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法 采集樣品營(yíng)養(yǎng)肉湯37 ℃培養(yǎng)24 h,伊紅美藍(lán)瓊脂分離大腸菌株,中心暗藍(lán)黑色并有綠色金屬閃光的菌落;挑取單菌在麥康凱瓊脂37 ℃培養(yǎng)24 h,培養(yǎng)形成紅色菌落;提取純化好的單菌落,進(jìn)行革蘭染色鑒定;配制乳糖復(fù)發(fā)酵培養(yǎng)基(1 L:蛋白胨20 g、乳糖10 g、0.04%溴甲酚紫水溶液25 mL、用1 mol/L NaOH 調(diào)pH 值7.2～7.4,115 ℃高壓滅菌15 min)觀察產(chǎn)氣;同時(shí)將單菌落接到30%甘油30 mL(H2O 70 mL,甘油30 mL,121 ℃高壓滅菌15 min) -20 ℃中保存。

細(xì)菌藥敏試驗(yàn)采用WHO 推薦的Kirby-Bauer法,測(cè)定大腸桿菌對(duì)3 類抗菌藥物,共8 種藥物的敏感性。依據(jù)美國(guó)臨床試驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(NCCLS)有關(guān)標(biāo)準(zhǔn),每次測(cè)定均以質(zhì)控菌為對(duì)照,只有當(dāng)質(zhì)控菌株的抑菌圈直徑在允許范圍內(nèi)測(cè)試菌株結(jié)果才有效。每次試驗(yàn)重復(fù)3 次,大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株為ATCC 25922(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院蘇戰(zhàn)強(qiáng)副教授提供)。結(jié)果判定按照NCCLS(2005 年版)進(jìn)行。按抗菌藥物敏感性試驗(yàn)擴(kuò)散法標(biāo)準(zhǔn)判定各菌株的敏感度,對(duì)所分離的細(xì)菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。以敏感(Sensitivity)、中介(Intermediate)、耐藥(Resistant)3 種形式對(duì)抑菌圈大小作出判定。測(cè)試各種藥敏紙片對(duì)大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 25922 產(chǎn)生的抑菌圈大小,觀察抑菌圈直徑是否在要求范圍內(nèi),判斷藥敏片是否合格。具體判斷標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 藥敏試驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌的分離鑒定 1 -3 月不同日齡犢牛糞源大腸桿菌分離率為100%。樣品伊紅美藍(lán)分離大腸菌株,中心暗藍(lán)黑色并有綠色金屬閃光的菌落;麥康凱瓊脂培養(yǎng)形成紅色菌落;純化單菌落,革蘭染色顯示陰性小桿菌;乳糖復(fù)發(fā)酵培養(yǎng)基產(chǎn)氣。

2.2 犢牛糞源大腸桿菌耐藥性分析 200 株?duì)倥＜S源大腸桿菌對(duì)8 種臨床常用抗菌藥物的耐藥結(jié)果見圖1。由圖1 可知,0 -90 日齡200 株?duì)倥Ｔ创竽c桿菌主要對(duì)阿米卡星(52.5%)1 種抗菌藥耐藥性超過50%,環(huán)丙沙星(30.5%)、諾氟沙星(29%)、恩諾沙星(29%)、慶大霉素(35.5)、阿莫西林(16%)、阿莫西林克拉維酸鉀(16.5%)7 種抗菌藥耐藥性較低,氨芐西林(3.5%)1 種抗菌藥耐藥性最低。

圖1 200 株?duì)倥＜S源大腸桿菌耐藥率分析/%

圖2 不同日齡犢牛糞源大腸桿菌耐藥率分析/%

2.3 不同日齡犢牛糞源大腸桿菌耐藥性分析 0 -30 日齡犢牛糞源大腸桿菌對(duì)8 種臨床常用抗菌藥物的耐藥結(jié)果顯示,氨芐西林(3.03%)、環(huán)丙沙星(13.6%)、阿莫西林(26%)和阿莫西林克拉維酸鉀(36.6%)4 種抗菌藥物敏感,而慶大霉素(57.14%)、諾氟沙星(59.3%)、恩諾沙星(64.5%)和阿米卡星(93.75%)逐漸出現(xiàn)敏感性降低,耐藥性增強(qiáng)現(xiàn)象。31-60 日齡犢牛糞源大腸桿菌對(duì)8 種臨床常用抗菌藥物的耐藥結(jié)果顯示氨芐西林(37%)、阿莫西林克拉維酸鉀(13%)、阿莫西林(14.2%)和諾氟沙星(37.9%)、環(huán)丙沙星(40.7%)5 種抗菌藥敏感率較高,恩諾沙星(50%)、慶大霉素(57.1%)、阿米卡星(81.4%)逐漸出現(xiàn)敏感性降低,耐藥性增強(qiáng)現(xiàn)象。31 -60 日齡犢牛糞源大腸桿菌對(duì)8 種臨床常用抗菌藥物的耐藥結(jié)果顯示阿米卡星(7.65%)、慶大霉素(29.75%)、恩諾沙星(36.65%)、諾氟沙星(39.75%)和環(huán)丙沙星(41.34%)5種抗菌藥敏感率較高,而阿莫西林(65%)、阿莫西林克拉維酸鉀(67.3%)和氨芐西林(92.7%)3 種抗菌藥逐漸出現(xiàn)敏感性降低,耐藥性增強(qiáng)現(xiàn)象。整體分析犢牛日齡與耐藥率成正比關(guān)系,耐藥趨勢(shì)為阿米卡星>恩諾沙星>諾氟沙星>慶大霉素>阿莫西林克拉維酸鉀>阿莫西林>環(huán)丙沙星>氨芐西林。

3 討論

大腸桿菌是多種動(dòng)物傳染性治病的病原菌,可在腸道大量繁殖,對(duì)抗生素的過度使用和濫用,使動(dòng)物體內(nèi)大腸桿菌的耐藥性越來越嚴(yán)重,未被分解的抗生素和耐藥菌隨糞便排出體外污染食品、水源、環(huán)境并引起人類感染[8]。大腸桿菌耐藥性廣泛,在動(dòng)物疾病的防治過程中慎用阿莫西林、恩諾沙星、諾氟沙星及環(huán)丙沙星。抗生素藥物使用前須利用藥敏試驗(yàn)來選擇敏感性較強(qiáng)的藥物進(jìn)行使用,此外也可與其他抗菌藥物聯(lián)合使用來進(jìn)行動(dòng)物疾病防治。這樣在增加療效的的同時(shí),也可以減少細(xì)菌耐藥性。動(dòng)物源細(xì)菌耐藥性的迅速出現(xiàn),不僅使原有的抗菌藥物失去作用,導(dǎo)致動(dòng)物疾病難以控制,而且這些耐藥菌很有可能通過污染環(huán)境、食品或人與動(dòng)物的接觸傳播給人,對(duì)人類的健康帶來更大的傷害。

獸醫(yī)臨床治療中氨基糖苷類為堿性抗菌藥,對(duì)需氧革蘭陰性桿菌、結(jié)核桿菌和金黃色葡萄球菌作用強(qiáng)。結(jié)果顯示200 株糞源大腸桿菌對(duì)氨基糖苷類抗菌藥耐藥性較嚴(yán)重,其中阿米卡星耐藥性達(dá)到52.5%,超過50%檢測(cè)株數(shù),此外慶大霉素耐藥性達(dá)到35.5%,導(dǎo)致此現(xiàn)象原因可能是犢牛在幼齡期消化系統(tǒng)未發(fā)育完全,冬季環(huán)境因素易導(dǎo)致犢牛消化不良,多數(shù)犢牛出現(xiàn)腹瀉病理,慶大霉素在獸醫(yī)臨床中主要用于下瀉,消化功能紊亂,因此慶大霉素大量使用導(dǎo)致耐藥性高。此外慶大霉素對(duì)幼畜/新生幼兒產(chǎn)生腎毒性和不可逆的耳毒性,建議限用或禁用[9-11]。

氟喹諾酮類是殺菌性抗菌藥,目前獸醫(yī)領(lǐng)域使用藥物種類10 余種,對(duì)革蘭陽性菌、革蘭陰性菌、衣原體、支原體作用更強(qiáng)[12]。結(jié)果顯示,環(huán)丙沙星(30.5%)、諾氟沙星(29%)、恩諾沙星(31.5%)3種抗菌藥耐水平均在30%(29%～31.5%),說明該場(chǎng)牛源大腸桿菌對(duì)氟喹諾酮類抗菌藥可能存在交叉耐藥。沙星類抗菌藥物廣泛應(yīng)用到牛、豬和禽類等動(dòng)物的肺部感染、泌尿生殖系統(tǒng)感染及支原體引起的疾病。冬季容易造成細(xì)菌、支原體引起肺炎或成群感染。因此治療階段沙星類藥物和TMP 進(jìn)行配合使用,增強(qiáng)沙星類藥物的抗菌療效,與磺胺、對(duì)氨基苯甲酸配合使用有協(xié)同作用,提高療效,避免單類抗菌藥重復(fù)使用造成耐藥性上升[13]。

β-內(nèi)酰胺類抗菌藥對(duì)革蘭陽性菌、革蘭陰性菌、厭氧菌類等作用強(qiáng),結(jié)果顯示氨芐西林、阿莫西林、阿莫西林克拉維酸鉀3 種抗菌藥耐藥性均低于20%,其中氨芐西林耐藥性僅為3.5%。β-內(nèi)酰胺類抗菌藥耐藥率最低,但日常治療過程中建議采取聯(lián)合用藥方式就診。從不同日齡犢牛源大腸桿菌耐藥率分析,犢牛日齡與耐藥率成正比關(guān)系,耐藥趨勢(shì)為阿米卡星>恩諾沙星>諾氟沙星>慶大霉素> 阿莫西林克拉維酸鉀> 阿莫西林> 環(huán)丙沙星>氨芐西林。該場(chǎng)耐藥性日益嚴(yán)重,這種產(chǎn)生的原因可能是由于濫用和不合理使用抗菌藥物導(dǎo)致耐藥性通染色體或其他在細(xì)菌間傳播,致使正常大腸桿菌對(duì)藥物環(huán)境的適應(yīng)性逐漸增強(qiáng),耐藥基因在細(xì)菌間相互傳遞和蔓延,因此導(dǎo)致多重耐現(xiàn)象的發(fā)生,使聯(lián)合用藥藥效降低影響動(dòng)物疾病的防治,養(yǎng)殖戶成本增加。