3 型鴨病毒性肝炎的診斷與病毒的分離鑒定

(上海創(chuàng)宏生物科技有限公司,上海閔行 201619)

鴨病毒性肝炎(Duck Viral Hepatitis)是嚴重危害雛鴨的急性、烈性傳染病,以3 周齡內(nèi)的雛鴨最易感染,死亡率高達80%,給養(yǎng)鴨業(yè)帶來了嚴重的經(jīng)濟損失。引發(fā)鴨病毒性肝炎的主要病原為1 型鴨甲型肝炎病毒(DHAV-1)、2 型鴨甲型肝炎病毒(DHAV-2)和3 型鴨甲型肝炎病毒(DHAV-3),DHAV-2 僅在臺灣地區(qū)有發(fā)病報道[1]。目前DHAV-1 和DHAV-3 同時流行,DHAV-3 流行范圍有擴大趨勢[2-3]。

2016 年4 月,江蘇某鴨場5 日齡櫻桃谷鴨發(fā)病,通過臨床癥狀、病理剖檢和實驗室診斷確定為鴨病毒性肝炎,并對病毒進行了分離和培養(yǎng),現(xiàn)將診斷過程報道如下。

1 材料與方法

1.1 血清 DHAV-3 陽性血清,由武漢中博生物股份有限公司惠贈,中和效價為1∶2 512。

1.2 雛鴨 10 日齡櫻桃谷鴨,購自河南華英農(nóng)業(yè)發(fā)展股份有限公司,從2 日齡隔離飼養(yǎng)至10 日齡。

1.3 臨床癥狀和病理剖檢 雛鴨精神沉郁,不愿采食,臥地不起,之后出現(xiàn)神經(jīng)癥狀,頭垂地,運動失調(diào),并很快死亡,死亡雛鴨呈角弓反張。剖檢可見肝臟腫大,布滿出血點和出血斑,腎臟、脾臟、胰臟均有出血,懷疑是鴨病毒性肝炎,建議鴨場緊急接種鴨病毒性肝炎高免卵黃抗體,頸部皮下注射,0.5 mL/只。

1.4 病料采集與處理 取病死鴨肝臟,按組織重量1∶5(W/V)加無菌生理鹽水后研磨制成勻漿,凍融后10 000 r/min 離心10 min,取上清液,提取病毒核酸并反轉(zhuǎn)錄,根據(jù)文獻方法[4]進行PCR 鑒定。將陽性擴增產(chǎn)物進行核苷酸序列測定,并將獲得的序列與GenBank 收錄的其他毒株進行比對鑒定,并分析遺傳進化關(guān)系。

1.5 病毒分離 將勻漿上清液用0.22 μm 針孔式濾器進行過濾,并將濾過液經(jīng)尿囊腔接種10 日齡易感鴨胚10 枚,0.2 mL/枚,置37 ℃孵化器孵育,記錄鴨胚死亡情況,收獲48 -144 h 死亡鴨胚的尿囊液,并進行無菌檢驗。將無菌檢驗合格的尿囊液,按同樣方法接種鴨胚盲傳2 代,即獲得第3 代尿囊液。

1.6 病毒純化 使用終點稀釋法對病毒進行純化[5]。具體方法如下:將第3 代尿囊液用無菌生理鹽水做10 倍系列稀釋,取10-3、10-4和10-5三個稀釋度,每個稀釋度經(jīng)尿囊腔接種10 日齡鴨胚5 枚,0.1 mL/枚,置37 ℃孵育。接種后觀察144 h,死亡胚于2～8 ℃冷藏(24 h 內(nèi)死亡胚棄去),將最高稀釋度致死的胚分別收獲尿囊液,按相同方法再連續(xù)傳代2 次,即獲得第6 代鴨胚尿囊液,并擴大培養(yǎng)收獲胚體制成第7 代病毒液。

1.7 病毒含量測定 取第7 代病毒液用無菌生理鹽水分別作10-3、10-4、10-5、10-6系列稀釋,每個稀釋度分別經(jīng)尿囊腔接種10 -11 日齡易感鴨胚5枚,0.1 mL/枚,置37 ℃孵育,觀察7 日,記錄死亡情況(24 h 內(nèi)死亡胚不計),按Reed-Muench 法計算鴨胚半數(shù)致死量(DELD50)。

1.8 PCR 鑒定 參照已報道的鴨常見病毒病檢測方法[6-8],檢測第7 代病毒液中是否含有鴨坦布蘇病毒、鴨瘟病毒、番鴨細小病毒、鴨乙型肝炎病毒和鴨呼腸孤病毒等常見病毒。

1.9 血清學(xué)鑒定 將第7 代病毒液用無菌生理鹽水稀釋至200 DELD50/0.2 mL,分為2 組,一組與等量DHAV-3 陽性血清混合;另一組與等量無菌生理鹽水混合,均置37 ℃作用1 h,分別經(jīng)尿囊腔接種10 -11 日齡易感鴨胚10 枚,0.2 mL/枚。置37 ℃孵育7 日,記錄鴨胚死亡情況(24 h 內(nèi)死亡胚不計)。

1.10 對雛鴨的毒力 將20 只10 日齡雛鴨隨機分為2 組,每組10 只,一組作為攻毒組,經(jīng)腿部肌肉接種10 倍稀釋的第7 代病毒液,0.5 mL/只;另一組作為空白對照組。攻毒后于隔離器中飼養(yǎng)觀察7 日,記錄雛鴨死亡情況,將死亡雛鴨剖檢,觀察病變情況。

2 結(jié)果

2.1 PCR 鑒定結(jié)果 使用3 型鴨甲型肝炎病毒引物擴增出1 條特異性條帶。將擴增產(chǎn)物進行核苷酸序列測定,并與GenBank 收錄的其他DHAV 毒株的VP1 基因序列進行比對,結(jié)果見圖1。第7 代病毒液VP1 基因序列與DHAV-3 代表毒株的同源率為91.8%～98.6%,與DHAV-2 代表毒株的同源性為72.5%,與DHAV-1 代表毒株的同源性為67.8%～68.2%。遺傳進化關(guān)系表明,第7 代病毒液所含病毒與DHAV-3 病毒株關(guān)系比較密切(圖2),確定為3 型鴨甲型肝炎病毒,命名為3 型鴨甲型肝炎病毒JS 株(DHAV-3 JS 株)。

圖1 序列比對

圖2 遺傳進化分析

2.2 病毒分離和純化結(jié)果 將病料接種10 日齡易感鴨胚后,鴨胚在120 h 內(nèi)5/5 死亡,剖檢,胚體出血,肝臟腫大出血(見中插彩版圖3)。收獲尿囊液連續(xù)傳代2 次鴨胚均在120 h 內(nèi)死亡,剖檢死亡鴨胚癥狀相同。將尿囊液繼續(xù)進行3 代純化傳代后,接種鴨胚,72 -96 h 出現(xiàn)死亡高峰。

圖3 病毒致死鴨胚

2.3 病毒含量測定結(jié)果 測定第7 代病毒液病毒含量為l05.83DELD50/0.1 mL。

2.4 PCR 鑒定結(jié)果 鴨坦布蘇病毒、鴨瘟病毒、番鴨細小病毒、鴨乙型肝炎病毒和鴨呼腸孤病毒擴增結(jié)果為陰性。

2.5 血清學(xué)鑒定結(jié)果 血清中和組鴨胚均不發(fā)生死亡,病毒對照組鴨胚全部死亡,表明JS 株能被DHAV-3 陽性血清中和。

2.6 對雛鴨的毒力試驗結(jié)果 攻毒組雛鴨在接種后2 d 內(nèi)發(fā)病,發(fā)病雛鴨精神沉郁,縮頸,隨即死亡,死亡鴨呈角弓反張,剖檢可見肝臟腫大,點狀或斑狀出血(見中插彩版圖4A);3 d 內(nèi)死亡70%。空白對照組雛鴨全部健活,無臨床癥狀,剖檢均無明顯病變(見中插彩版圖4B)。

圖4 雛鴨剖檢肝臟圖片

3 討論

鴨病毒性肝炎是危害養(yǎng)鴨業(yè)的主要疾病之一。近年來,鴨病毒性肝炎病原在我國的分布比較復(fù)雜,DHAV-1 仍在我國養(yǎng)鴨業(yè)流行,但是DHAV-3 的流行已非常廣泛[9],已成為我國養(yǎng)鴨業(yè)主要流行的基因型。本試驗通過發(fā)病鴨的臨床癥狀、病理剖檢并結(jié)合實驗室診斷確定導(dǎo)致該養(yǎng)鴨場發(fā)病死亡的病原為3 型鴨甲型肝炎病毒。通過動物回歸試驗,將病毒接種雛鴨后,雛鴨死亡率為70%,表明該病毒毒力較強,鴨場在緊急接種鴨病毒性肝炎高免卵黃抗體后,雛鴨發(fā)病情況已得到有效控制,發(fā)病率和死亡率降低,但是并未得到根除,每天仍有雛鴨發(fā)病和死亡,鴨場已在首次接種卵黃抗體5 d 后再次進行接種。

做好鴨場的生物安全工作是預(yù)防鴨病毒性肝炎的有效方法,然而在我國目前公司+農(nóng)戶的養(yǎng)殖模式下,很多地區(qū)養(yǎng)鴨條件較為有限,很難做到徹底消毒,發(fā)生鴨病毒性肝炎后很容易造成細菌的繼發(fā)感染,給養(yǎng)殖戶帶來經(jīng)濟損失;因此在購進雛鴨之后進行活疫苗免疫是預(yù)防該病的關(guān)鍵,然而目前市場上尚無3 型鴨甲型肝炎活疫苗,應(yīng)當加快研發(fā)進程。