高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒微滴式數字PCR 檢測方法的建立及初步應用

王 林 ,孫 丹 ,韋海濤 ,宋彥軍 ,周德剛 ,高曉龍 ,梅 力,馮小宇

(1.北京市動物疫病預防控制中心,北京大興102600 ;2.北京市獸醫藥品監察所,北京大興 102600)

豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS),俗稱“豬藍耳病”,是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的一種嚴重危害養豬業發展的病毒性傳染病[1]。2006 年,我國出現高致病性PRRSV 毒株,導致嚴重型PRRS 的暴發,給我國養豬業造成了巨大的經濟損失[2-3]。

目前實驗室用于檢測高致病性PRRSV 的分子生物學方法主要有RT-PCR 和熒光定量PCR,RTPCR 產物容易污染且只能定性檢測,熒光定量PCR做定量檢測時需要建立標準曲線。微滴式數字PCR(Droplet digital PCR,ddPCR)作為第3 代PCR技術,具有檢測復雜來源樣品中極低含量核酸分子和無須標準曲線直接絕對定量的檢測技術[4]。目前廣泛應用到轉基因作物成分檢測[5]和臨床抗病毒治療效果的評估[6]的研究領域中。本試驗通過對微滴式數字PCR 檢測高致病性PRRSV 毒株的退火溫度、引物和探針濃度等反應條件的優化,以及特異性、敏感性、重復性和臨床樣本檢測的研究,建立了基于ddPCR 技術的高致病性PRRSV 的絕對定量檢測技術,為高致病性PRRSV 的早期快速檢測提供了新的技術手段,也為北京市高致病性PRRS 的防控提供了技術支持。

1 材料

1.1 病毒 滅活的PRRSV 高致病性病毒和PRRSV 低致病性病毒由中國動物疫病預防控制中心提供。

1.2 臨床樣本 10 份臨床樣本為2016 年采集的北京豬場高致病性PRRS 病料。

1.3 儀器與試劑 QX100 微滴式數字PCR 儀、QX100 Droplet Generator、PX1 Plate Sealer、QX100 Droplet Reader、CFX96 Touch 熒光定量PCR 儀,均購自美國伯樂公司;NanoDrop 紫外分光光度計,購自美國賽默飛公司;RNA 提取試劑盒,購自北京世紀元亨動物防疫技術有限公司;TaKaRa One-step primescript RT-PCR Kit,購自寶生物工程(大連)有限公司;One-step RT-ddPCR Advanced Kit for Probes、Droplet generation oil for probe 和Droplet reader oil均,購自美國伯樂公司。pMD19-T 載體、TaqDNA聚合酶、DL-2000 DNA Marker、DNA 提取試劑盒、凝膠回收試劑盒,均購自寶生物工程(大連)有限公司。

2 方法

2.1 引物和探針 根據GenBank 已發表的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒非結構蛋白2(NSP2)基因序列,用Primer Premier 5.0 軟件設計引物和探針(表1),引物和探針由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 引物和探針序列

2.2 病毒DNA/RNA 的提取 各取相應的病毒液100 μL,根據北京世紀元亨動物防疫技術有限公司病毒RNA 提取試劑盒說明書操作步驟提取高致病性PRRSV 的總RNA,置于-70 ℃保存備用。

2.3 微滴式數字PCR 微滴式數字PCR 試驗使用的是伯樂公司的QX100 微滴式數字PCR 儀,主要包括微滴生成、PCR 擴增和微滴讀取3 個主要試驗步驟。

2.3.1 微滴生成 采用ddPCR Supermix for Probe試劑推薦的20 μL 體系,以相同濃度的病毒RNA 為模板,選用優化好的上游、下游引物濃度和探針濃度,加入2 × One-step RT-ddPCR supermix 10 μL,25 mM Manganese acetate solution 0.8 μL(1 mM),加無RNA 酶水補齊至20 μL,在微滴生成卡中加入70 μL微滴生成油,將生成卡放入微滴生成儀,生成微滴。

2.3.2 PCR 擴增 將生成的微滴轉移至96 孔板內,用PX1 熱封儀進行封膜。將封好膜的96 孔板放在伯樂PCR 儀器上進行PCR 擴增。PCR 的擴增程序為50 ℃反轉錄10 min; 95 ℃預變性3 min;94 ℃變性10 s,退火50～60 ℃60 s,共40 個循環;98 ℃10 min 結束反應。

2.3.3 微滴讀取 將擴增完的96 板放入QX100微滴讀取儀上,運行QuantSoft 軟件,進行微滴結果讀取。

2.4 微滴式數字PCR 反應條件優化

2.4.1 退火溫度的優化提取高致病性PRRSV RNA 為模板。然后在QX100 ddPCR 平臺上,ddPCR體系配方:4 × One-step RT-ddPCR Supermix 5 μL,RE 2 μL,DT 1 μL,上下游引物各1 μL,探針0.5 μL,RNase Free dH2O 7.5 μL,陽性模板2 μL,總體積20 μL(引物和探針的濃度均為10 μM)。做8個復孔,然后生成微滴,轉移到96 孔板內,封鋁膜。PCR 擴增程序為:50 ℃反轉錄10 min;95 ℃預變性10 min;94 ℃變性30 s,50～60 ℃(儀器自動分布8 個溫度梯度)退火60 s,共40 個循環;98 ℃10 min,升降溫速度都設2.5 ℃/s,結束反應。上微滴數字PCR 檢測儀檢測。

2.4.2 引物和探針濃度的優化 采用ddPCR Supermix for Probe 試劑推薦的20 μL 體系,以相同濃度的病毒RNA 為模板,分別對引物濃度和探針濃度組合(650 nM +150 nM、900 nM +250 nM 和1 150 nM +350 nM)和退火溫度(50 ℃、51 ℃、52 ℃、54 ℃、56 ℃、58 ℃、59 ℃、60 ℃)進行優化,重復進行3 次試驗,求平均值,確定最佳的引物濃度、探針濃度和退火溫度。

2.5 微滴式數字PCR 特異性、重復性和敏感性試驗

2.5.1 特異性試驗 用建立的數字PCR 方法分別對PRRSV 高致病性毒株,PRRSV 低致病性毒株,豬圓環病毒2 型,豬傳染性胃腸炎病毒,豬流行性腹瀉病毒,豬瘟病毒和口蹄疫病毒進行檢測,驗證該方法的特異性。

2.5.2 重復性試驗 選取3 份高致病性PRRSV 陽性樣本與2 份陰性樣本,分別進行批內重復試驗與批間重復試驗,每份樣本重復檢測8 次,并計算標準偏差及變異系數。

2.5.3 靈敏性試驗及與熒光定量PCR(qPCR)比對試驗 將0.8 ng/μL 的質粒DNA 進行10 倍稀釋,連續稀釋7 個梯度,編號1～7,分別在QX100 的平臺上進行ddPCR 試驗和熒光定量儀做熒光定量試驗,比較檢測方法的靈敏性。

2.6 臨床樣本的檢測 利用本試驗建立的ddPCR方法對臨床上感染HP-PRRSV 的10 份樣本進行檢測,同時設立陰性、陽性對照。

3 結果

3.1 退火溫度的優化 分別計算溫度在50 ℃、51 ℃、52 ℃、54 ℃、56 ℃、58 ℃、59 ℃、60 ℃共8 個梯度,3 次重復試驗測得標準樣品的平均值,結果分別為84.9、80.9、82.7、82.7、88.1、82.3、81.4、82.5拷貝/μL(圖1),在退火溫度為56 ℃時,檢測樣品的拷貝數最多,所以確定最佳的退火溫度為56 ℃。

圖1 不同退火溫度檢測的拷貝數

3.2 引物和探針濃度的優化引物和探針濃度的優化采用3 組不同濃度的組合進行篩選最佳反應濃度,分別為第1 組(引物濃度650 nM+探針濃度150 nM)、第2 組(引物濃度900 nM+探針濃度250 nM)、第3 組(引物濃度1 150 nM+探針濃度350 nM)。結果顯示,第1 組、第2 組和第3 組檢測病毒拷貝數分別為0 拷貝/μL、13.8 拷貝/μL 和13.4 拷貝/μL,第2 組引物和探針濃度組合檢測的病毒拷貝數最多,所以確定最佳的引物和探針濃度分別900 nM 和250 nM(圖2)。

3.3 微滴式數字PCR 特異性和重復性試驗 本試驗建立的高致病性PRRSV 數字PCR 檢測方法分別檢測PRRSV 美洲型高致病性毒株,PRRSV 美洲型經典株,豬圓環病毒2 型,豬傳染性胃腸炎病毒,豬流行性腹瀉病毒,豬瘟病毒,口蹄疫病毒,結果顯示,PRRSV 美洲型高致病性毒株檢測結果為129 拷貝/μL,其他均為0 拷貝/μL(圖3)。重復性試驗結果顯示,3 次重復性試驗的變異系數小于5%,表明具有良好的重復性(表2)。

圖2 不同引物和探針濃度檢測的拷貝數圖

圖3 ddPCR 特異性驗證拷貝數圖

表2 重復性試驗

3.4 微滴式數字PCR 靈敏性試驗 將連續倍比稀釋好的陽性標準質粒分別進行qPCR 和ddPCR 試驗。結果顯示,數字PCR 的R2值為0.999 1(圖4),線性關系良好,表明檢測方法可靠。ddPCR 靈敏度比qPCR 高10 倍,且能實現核酸含量的絕對定量(表3)。

表3 熒光定量PCR CT 值與數字PCR 拷貝數值比較

圖4 ddPCR 標準曲線圖

3.5 微滴式數字PCR 對臨床樣本中拷貝數的定量檢測應用 對臨床上感染高致病性PRRSV 的10 份樣本,進行微滴式數字PCR 定量檢測檢測結果分別為1 980、97 000、4 200、203、104 000、823、197、822、2 150和202 拷貝/μL,表明建立好的ddPCR 方法能對臨床樣本進行絕對定量。

4 討論

更準確和更靈敏的檢測技術是分子生物學的發展方向,而微滴式數字PCR 作為第3 代PCR,與第1 代普通PCR 和第2 代熒光定量PCR 相比,具有靈敏性更高和直接絕對定量的檢測優勢。其主要原理是通過DNA 有限稀釋法和泊松分布的統計原則來準確計算DNA 的濃度,能夠在復雜背景條件下檢測靶基因序列[7]。數字PCR 作為新一代分子診斷工具,已經越來越廣泛應用到產前診斷[8]、癌癥檢測[9]、病原檢測[4,10-11]、基因突變檢測[12]和轉基因研究[13]等。而利用ddPCR 對高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒的研究和應用相對較少。

本試驗針對高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒NSP2 基因序列設計特異性引物和探針,并進行了最佳反應退火溫度、最佳引物濃度、最佳探針濃度、特異性試驗、靈敏性試驗和重復性試驗等一系列試驗,建立了高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒ddPCR 檢測方法。試驗表明最佳的退火溫度為56 ℃,最佳引物濃度和探針濃度分別為900 nM 和250 nM。微滴式數字PCR 的檢測結果與標準品拷貝數的相關系數為R2=0.999 1,表明該方法檢測結果具有良好的線性關系和可信度。將建立的ddPCR方法與qPCR 方法進行比較和分析,試驗表明,ddPCR 最低檢測限度為3.5 拷貝/μL,靈敏度比qPCR 高10 倍,因此具有較高的靈敏度,在早期感染或潛伏感染診斷中具有巨大的潛力。特異性和重復性試驗結果表明,ddPCR 具有良好的特異性,與其他豬常見病毒不發生交叉反應,且重復性較好。對10 份臨床樣品的檢測結果表明,ddPCR 可以對臨床樣品的病毒含量進行絕對定量。因此,本試驗建立的ddPCR 檢測方法靈敏度高、特異性強、能夠快速檢測到極低的HP-PRRSV,適用于HP-PRRSV 的早期檢測和流行病學調查,為PRRSV 的防控和科學研究提供了有力的技術儲備。