基于ITS序列對市售常見食用菌的鑒定及系統發育研究

宋立志

(遼寧省楊樹研究所，遼寧蓋州115213)

食用菌俗稱“蘑菇”，是一類可供人類食用的大型真菌，鮮食美味可口，干菇有濃郁的香味，風味獨特，有“素中之葷”的美名。食用菌富含蛋白質、氨基酸、維生素并兼具食療價值。我國目前進行商業性栽培的食用菌種類大約有四五十種，但在產品名稱上，經常發生商業名稱、學名和俗名相互混淆和張冠李戴現象，甚至同物異名、同名異物[1]。做好食用菌菌種鑒定及種質資源保存，是保證食用菌良種在生產中發揮最佳栽培效果的主要措施之一，是相關研究人員應該尤為重視的工作。

食用菌的菌種鑒定目前采用的基本上是傳統形態特征結合ITS(Internal transcribed spacer)序列分析來完成。 ITS是核糖體rDNA中介于18S與5.8S之間、5.8S與28S之間的內部轉錄間隔區，其保守性表現為種內相對一致，種間高度特異[2]。本研究通過 ITS序列分析方法對市售5種食用菌子進行分子鑒定，初步確定分類學地位，為食用菌種質資源提供了依據。

1 材料與方法

1.1 供試菌種

供試真姬菇、杏鮑菇、蟹味菇、香菇和平菇購自遼寧省蓋州市聚富市場，各食用菌形態見圖1，分別標記為ZJG、XBG、XW、XG、PG。

圖1五種常見食用菌子實體形態

從左至右依次為ZJG、XBG、XW、XG、PG

1.2 培養基

供試培養基采用PDA培養基：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂粉15g，水1000mL，pH自然。稱取馬鈴薯200g并切成1cm見方的小塊，放入水中煮沸20～30min，用八層紗布進行過濾，過濾后加入葡萄糖、瓊脂，繼續加熱攪拌混勻，稍冷卻后再補足水分至1000mL，分裝錐形瓶，121℃，0.15MPa高壓滅菌20min，備用。

1.3 酶及生化試劑

TIANGEN DNAsecure新型植物基因組DNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；TaqDNA Polymerase購自Thermo公司；引物采用真菌通用引物ITS1、ITS4，由TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司合成。引物序列為：ITS1:5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’；ITS4:5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。

1.4 試驗方法

1.4.1 菌種分離。子實體用75%酒精輕輕擦拭2～3遍，在超凈工作臺中，將子實體沿菌蓋中央輕輕掰開，用解剖刀在子實體菌柄與菌蓋交界處取黃豆粒大的菌肉接種至PDA平板培養基中，每個平皿接種1塊菌肉，用封口膜封口后置于25℃生化培養箱中進行暗培養，待菌落直徑達到1cm后，挑取邊緣新鮮菌絲進行轉接純化培養，轉接2～3次，培養好的菌種置于4℃冰箱中存放。

1.4.2 菌絲DNA提取及凝膠電泳檢測。菌絲25℃下靜置培養7d后，刮取菌落邊緣的新鮮菌絲，使用TIANGEN公司的DNAsecure新型植物基因組DNA提取試劑盒進行基因組DNA提取，具體操作方法按說明書進行，提取的DNA溶于TE中，并置于-20℃保存備用。取6μL提取的DNA經1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，用Syngene G:BOX凝膠成像系統進行拍照。

1.4.3 ITS-PCR擴增及序列比對。以基因組DNA為模板，應用真菌通用引物對ITS1和ITS4進行PCR擴增，ITS-PCR擴增體系為：10×PCR Buffer 2.5μL，dNTP(2.5mmol/L)2μL，引物(10μmol/L)0.5μL，rTaqDNA 聚合酶(5U/μL)0.25μL，模板DNA 1μL，用ddH2O補足至25μL。PCR擴增程序為：94℃預變性5min，94℃變性30s，55℃退火45s，72℃延伸45s，共30個循環，最后72℃延伸10min，終止溫度在4℃。反應結束后取6μL產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測電泳結果，PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測后送至TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司進行測序。測序結果登錄GenBank進行BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome)比對。

1.4.4 系統樹構建。測序結果登錄GenBank進行BLAST比對，找出與之最大相似性的序列，下載相似性序列的ITS區域，用Clustalw進行多序列比對，并輔以人工修正，分析時所有參數均為軟件默認值。用MEGA 5.0軟件采用N-J法構建系統發育樹，進行系統發育分析，構建發育時進行自舉檢驗，重復抽樣1000次。

2 結果分析

2.1 菌絲DNA提取及ITS-PCR擴增

提取的DNA經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(見圖2)，PG、XBGDNA條帶清晰、較明亮，無明顯后拖尾現象，說明基因組DNA完整，可以作為PCR反應的模板。ZJG、XW和XG的DNA雖然有輕微拖尾，但DNA濃度較高，也可以作為PCR反應的模板。以提取的DNA為模板，ITS1、ITS4為引物對rDNA ITS區段進行PCR擴增，擴增結果顯示各片段大小約為600～700bp(見圖3)，與預期結果一致。

圖2 DNA瓊脂糖凝膠電泳圖譜

M為DL 2000 DNA Marker；CK為水對照；1,2為PG；3,4為XBG；5為ZJG；6為XW；7為XG

圖3 PCR產物電泳圖

M為DL 2000 DNA Marker；CK為水對照；1～2為PG；3～5為ZJG；6～7為XB；8～10為XW；11為XG

2.2 序列比對及系統發育分析

rDNA ITS區段序列測定結果顯示，各片段長度在620～751bp，具體比對結果如下，系統發育樹見圖4：

(1)XW序列測定結果顯示， PCR擴增產物長度為628bp，測序結果登錄GenBank經Blast比對，與XW同源性最高的菌株序列號分別為：JN234834.1、HM561968.1、JX046031.1、KP765747.1、JX046026.1等，相似性為99%，均為Hypsizygusmarmoreus。

(2)ZJG序列測定結果顯示，PCR擴增產物長度為630bp，登錄GenBank經Blast比對，與ZJG同源性最高的菌株序列號分別為：JX046031.1、JN234834.1、HM561968. 1、MH453612.1、KP765747.1等，相似性為100%，均為Hypsizygusmarmoreus。XW與ZJG比對之后菌種名相同。系統發育分析表明XW、ZJG與Hypsizygusmarmoreus(HM561968. 1)等聚為1支，置信度為87%，初步確定XW和ZJG為Hypsizygusmarmoreus。Hypsizygusmarmoreus(Peck) H.E.Bigelow又名Maki Mushroom，為真姬菇也叫姬菇、玉蕈、斑玉蕈，屬擔子菌亞門(Basidiomycotina)、層菌綱(Hymenomycetes)、傘菌目(Agaricales)、白蘑科(Tricholomataceae)、玉蕈屬(Hypsizygus)。真姬菇在日本稱之為“蟹味菇”、“海鮮菇”。外形美觀，質地脆嫩，味道鮮鮮，具有海蟹味，目前，栽培品種有淺灰色和純白色2個品系，白色品系又稱為“白玉蘑”。

(3)PG序列測定結果顯示， PCR擴增產物長度為621bp，測序結果登錄GenBank經Blast比對，與B6同源性最高的菌株序列號分別為：LN877896.1、MG840767.1、MG819736.1、MG819161.1、MG282484.1等，相似性為99%，為Pleurotusostreatus。系統發育分析表明PG與Pleurotusostreatus(登錄號：LN877896.1)聚為一支，置信度為100%，初步確定PG為Pleurotusostreatus。Pleurotusostreatus中文名為側耳，又名平菇、北風菌、青蘑、桐子菌、糙皮側耳，屬擔子菌門、傘菌綱、傘菌目、側耳科(Pleurotaceae)、側耳屬(Pleurotus)。

(4)XBG序列測定結果顯示，PCR擴增產物長度為620bp，測序結果登錄GenBank經Blast比對，與XB同源性最高的菌株序列號分別為：FJ572244.1、MG819740.1、MG2824890.1、MG282459.1、KY962500.1等，覆蓋度100%，相似性為99%，為Pleurotuseryngii和Pleurotusfuscus。Pleurotusfuscus為杏鮑菇的異名之一[3]。系統發育分析表明XBG與Pleurotusfuscus(登錄號：MG282459.1)等聚為一支，置信度為81%，初步確定XBG為Pleurotusfuscus。Pleurotusfuscus為杏鮑菇又名刺芹側耳，屬擔子菌亞門、層菌綱、傘菌目、側耳科、側耳屬(Pleurotus)。

(5)XG序列測定結果顯示，PCR擴增產物長度為751bp，測序結果登錄NCBI經Blast比對，結果表明，與XG相似性最高的菌株序列號分別為：MH141994.1、MH856832.1、AB286067.1、AB286064.1、DQ467888.1菌種名稱均為Lentinulaedodes，Query cover 98%～ 100%，ident均為99.46%～99.73%。系統發育分析表明XG與Lentinulaedodes(登錄號：MH141994.1)聚為1支，置信度為99%，初步確定XG為Lentinulaedodes。Lentinulaedodes為香菇又名冬菇、香蕈、北菇、厚菇、薄菇、花菇、椎茸，是一種食用真菌。屬傘菌亞門、傘菌綱、傘菌目、光茸菌科 (Omphalotaceae)、香菇屬 (Lentinus)。

圖4 五種食用菌系統發育樹狀圖

3 結論與討論

眾所周知，食用菌子實體的發生和形態受外界環境條件影響很大，應用子實體形態對菌種進行鑒定存在一定的局限性。近年來隨著分子生物學技術的發展，國際核酸數據庫信息資源的不斷豐富，ITS等分子鑒定手段逐漸被人們所關注。ITS核糖體rDNA內部轉錄間隔區序列通過與GenBank數據庫進行BLAST檢索比對，序列相似性≥99%，可以鑒別為相同種；序列相似性為95%～99%，可以鑒別為相同屬[2]。ITS序列分析無論在無法人工栽培的菌根菌還是可栽培的常用食用菌鑒定中，應用越來越廣泛，并在紅菇[4]、鵝膏菌[5]、松乳菇[6]、卷邊樁菇[7]、大肥菇[8]、蒙古口蘑[9]、硫磺菌[10]、深凹漏斗傘[11]等鑒定中成功應用。

本文結合ITS序列分析對市售常見的食用菌進行了分子鑒定，結果表明真姬菇和蟹味菇為玉蕈屬的Hypsizygusmarmoreus， 平菇為側耳屬的Pleurotusostreatus，杏鮑菇為側耳屬的Pleurotusfuscus，香菇為香菇屬的Lentinulaedodes。研究結果為進一步篩選優良菌種，提高產量，優化母種等研究提供了理論基礎。