水氮耦合對苗期葡萄葉片氮素代謝酶活性的影響*

李佳帥，楊再強,2**，王明田，韋婷婷，趙和麗，江夢圓，孫 擎，黃琴琴

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水氮耦合對苗期葡萄葉片氮素代謝酶活性的影響*

李佳帥1，楊再強1,2**，王明田3，韋婷婷1，趙和麗1，江夢圓1，孫 擎1，黃琴琴1

（1．南京信息工程大學氣象災害預報預警與評估協同創新中心，南京 210044；2．江蘇省農業氣象重點實驗室，南京 210044；3．四川省氣象局，成都 610071）

為研究水氮耦合對苗期葡萄葉片氮代謝影響及最佳施氮量的制定，以一年生葡萄品種紅提為研究試材，利用人工控制環境的方法，在溫室內采用水、氮兩因素各4水平的全面設計進行實驗，水分處理分別為正常灌溉W1（田間最大持水量的70%～80%）、輕度脅迫W2（60%～70%）、中度脅迫W3（50%～60%）和重度脅迫W4（30%～40%）。4個氮素施用水平分別為1.5倍推薦施肥N1（施純氮25.5g·m?2）、正常推薦施肥N2（17g·m?2）、0.5倍推薦施肥N3（8.5g·m?2）、不施用氮肥N4（不施氮）。處理時間為10、20、30、40d。結果表明，在水分條件適宜時，葡萄葉片硝酸還原酶（NR）、谷氨酰胺合成酶（GS）、谷氨酸合成酶（GOGAT）活性、可溶性蛋白、游離氨基酸含量隨施氮量增加而提高；在輕度干旱脅迫時，增施氮肥可緩解干旱脅迫；在重度干旱脅迫時，高氮處理使設施葡萄葉片中氮代謝酶活性、游離氨基酸和可溶性蛋白含量降低。葡萄葉片內氮含量始終隨處理時間增加而降低，在輕度水分脅迫下氮的轉運率較高，而水分脅迫嚴重時，高氮處理與無氮處理時氮轉運率均偏低。最終得出：在水分條件適宜（W1）和輕度水分脅迫（W2）下，N1處理葡萄葉片的氮代謝能力最高；在中度水分脅迫（W3）和重度水分脅迫（W4）下，N3、N4處理氮代謝能力最高。研究結果可為實際生產中設施葡萄的干旱災害防控提供理論依據，既能有效緩解水分脅迫帶來的危害，又避免生產中肥料的浪費。

葡萄；氮代謝酶；水氮脅迫；氮含量；最佳施氮量

葡萄（）屬落葉多年生藤本植物，在全球果品生產中，其產量及栽培面積均居首位。葡萄富含營養、口味佳、用途廣，因此經濟價值極高。隨著市場需求逐漸加大，栽培面積也逐漸增加，截至2014年，中國葡萄栽培總面積超過80萬hm2，設施葡萄栽培面積13.3萬hm2，居世界第一[1]。江蘇省葡萄種植面積近4萬hm2，以鮮食葡萄為主[2]。近年來，水分虧缺給秋冬季溫室葡萄基肥的管理工作造成一定困擾，其中氮素是葡萄生長發育中重要元素之一，施氮量將直接影響植株氮代謝活動，從而影響葡萄的品質及產量。氮代謝是植物生長發育中重要生理代謝過程之一[3]，正常環境條件下，外來的NO3?-N進入細胞后，首先在位于細胞質中的硝酸還原酶（nitrate reductase，NR）的作用下還原成亞硝酸鹽，亞硝酸鹽再進一步還原成 NH4+。NR作為植物NO3?同化的第一個關鍵性誘導酶，同時也是硝酸鹽同化的限速酶，其活性高低直接影響介質中NO3?的利用，且包括氨基酸和蛋白質等物質的合成[4]。Andrews等[5]研究發現，NR活性對環境敏感，隨施氮水平提高而提高。谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，GS）/谷氨酸合成酶（glutamine-α-oxoglutarate aminotransferase，GOGAT）途徑是高等植物同化銨態氮（NH4+）的主要途徑[6?7]，進入植物體的NH4+-N在GS、GOGAT作用下被迅速同化為氨基酸和蛋白質，以降低NH4+-N在細胞組織中的含量，減少毒害[8]，其兩者是植物體內游離氨基酸和可溶性蛋白等大分子合成的主要供體[9?10]。張華珍等[11?12]也研究表明GS、GOGAT有協同作用。

目前，國內外學者就不同水、氮水平對氮代謝酶活性的影響作了相關研究。于坤等[13]研究表明，水分適宜時增加施氮可提高葡萄幼苗葉片氮含量并保持葉片NR、GS的高活性；張麗瑩等[14]對黃瓜葉片研究發現，在低肥水平下較低的灌水量會提高葉片中NR、GS活性，而在中肥和高肥水平下中等灌水量最有利于NR、GS活性的提高。張智猛等[15]研究花生葉片發現，適當提高氮素水平既能增加花生葉片中可溶性蛋白質和游離氨基酸含量，又能提高NR、GOGAT等氮素同化酶的活性，使其同步增加，然而施氮量過高雖能提高NR、可溶性蛋白質和游離氨基酸的含量，但GS活性下降；王月福等[16]研究冬小麥旗葉提出，適當增施氮肥能提高NR和GS活性，且葉片可溶性蛋白含量也表現出相似的變化；趙宏偉等[17]研究表明，春玉米穗位葉片NR、GS活性隨施氮水平升高有明顯增加，而葉片可溶性蛋白含量受氮素水平影響較?。辉兰t賓等[18]研究發現，煙草葉片提高氮素水平時NR活性升高。以往研究多為氮肥對葡萄生理生態、生物學特性的報道，而有關葡萄幼苗期不同水、氮處理對葉片氮含量、氮轉運率及氮素代謝的系統研究報道較少。本研究針對水氮耦合對葡萄葉片氮代謝的影響開展實驗，旨在初步得出不同水分條件下的最佳施氮量，以期為葡萄的優培和合理水肥運籌提供理論依據與技術支持。

1 材料與方法

1.1 實驗設計

實驗于2017年9?12月在南京信息工程大學農試站Venlo型實驗玻璃溫室內進行（N32°12′19.48″，E118°42′36.11″），地處亞熱帶季風氣候區，溫室頂高5.0m，肩高4.5m，寬9.6m，長30.0m，南北走向。以一年生葡萄苗紅提為試材。供試土壤為中壤土，pH7.4，有機質含量18.32g·kg?1，全氮0.86g·kg?1，全磷0.75g·kg?1，田間持水量32.45%。

待植株葉片超過15葉后定植于4個長8m、寬1m、深1m的水泥池苗床內，開始灌水量和施氮量兩因素實驗，每個因素設4個水平，每個水泥池苗床內為同一水分處理，處理間不存在側漏，灌溉方式為澆灌，通過EM50（DecagonDevice.USA）采集土壤深度30cm處水分數據，獲得每小時土壤水分數據，4個水分處理梯度[19]分別為，正常灌溉W1（田間最大持水量的70%～80%）、輕度脅迫W2（田間最大持水量的60%～70%）、中度脅迫W3（田間最大持水量的50%～60%）、重度脅迫W4（田間最大持水量的30%～40%）。利用PE塑料薄膜將每個水泥池分成4個區域，設置4個施氮梯度。查閱文獻并計算得出，葡萄生長初期的推薦施氮量[20?21]為純氮17g·m?2，因此，試驗設置4個氮素指標分別為，1.5倍推薦施肥（N1）；正常推薦施肥（N2）；0.5倍推薦施肥（N3）；不施用氮肥（N4）。對水、氮兩因素進行全面設計，共16個處理如表1所示，葉片鮮樣采集在9：00?11：00進行，共取4次。當天樣品用液氮速凍，并集于?20℃冰箱中備用，采樣完畢后，統一測定相關指標，實驗期間，除控制變量外，其它管理措施正常。

表1 實驗設計

Table 1 Experimental design

1.2 測量項目與方法

1.2.1 溫室小氣候數據

實驗期間溫室內平均氣溫為15.6℃，日最高氣溫27.3℃，最低氣溫8℃。實驗正值秋冬季，日平均氣溫呈下降趨勢。溫室內平均空氣相對濕度為81%，最高為96%，最低為54%，呈波動變化。平均日光合有效輻射累計值為5.02MJ·m?2，最高為6.91MJ·m?2，最低為3.94MJ·m?2，期間溫室內光合有效輻射值變化平穩。期間土壤水分雖有波動，但均在各水分梯度范圍內。

1.2.2 指標測定

（1）氮含量

將采集的植株葉片鮮樣烘干至恒重，粉碎后用H2SO4?H2O2消化，最后用凱氏法蒸餾測定全氮含量（g·kg?1）[22]。

（2）氮轉運率

氮轉運率指氮轉運量占起始植株葉片氮含量的百分比。

式中，W表示氮轉運率（%），C0表示第一次即處理第10天所取樣品中的氮含量（g·kg?1），C1表示最后一次即處理第40天所取樣品中的氮含量（g·kg?1）。

（3）可溶性蛋白含量

采用考馬斯亮藍比色法測定[23]

式中，Spc為可溶性蛋白含量（mg·g?1），C為標準曲線值（g），VT為提取液總體積（mL），WF為樣品鮮重（g），VS為測量時加樣量（mL）。

（4）硝酸還原酶活性（NR，mg·g?1·h?1）

采用離體法[24]測定，即

式中，x為反應液酶催化產生的亞硝態氮總量（mg），V1為提取酶時加入的緩沖液體積（mL），V2為酶反應時加入的粗酶液體積（mL），W為樣品鮮重（g），t為反應時間（h）。

（5）谷氨酰胺合成酶活性（GS）

取鮮樣1g，加3mL提取緩沖液（pH8.0，內含0.05mol·L?1Tris-HCl，2mmol·L?1Mg2+，2mmol·L?1DTT，0.4mol·L?1蔗糖），冰浴研磨至勻漿，4℃下15000g離心20min，上清液即為酶粗提液。接著進行顯色反應，1.6mL反應混合液B（0.1mol·L?1Tris-HCl緩沖，pH7.4，內含80mmol·L?1Mg2+，20mmol·L?1谷氨酸鈉鹽，2mmol·L?1半胱氨酸和2mmol·L?1EGTA，再加入80mmol·L?1鹽酸羥胺），加入0.7m粗酶液和0.7mLATP溶液，混勻，于37℃下保溫30min，加入顯色劑1mL（0.2mol·L?1TCA，0.37mol·L?1FeCl3和0.6mol·L?1HCl混合液），搖勻并放置片刻后，于5000g下離心10min，取上清液測定540nm處的吸光值。

式中，GS活性單位為A·mg?1protein·h?1，A為540nm處的吸光值，P為粗酶液中的可溶性蛋白含量，V為反應體系中加入的粗酶液體積，t為反應時間。

（6）谷氨酸合成酶活性（GOGAT）

提取液同GS，反應混合液包括20mmol·L?1的L-谷氨酰胺0.4mL，20mmol·L?1的α-酮戊二酸0.5mL，10mmol·L?1的KCL 0.1mL，30mmol·L?1的NADH 0.2mL和0.3mL酶液，總體積3mL，不足部分用pH7.6濃度為0.05mol·L?1的Tris-HCl緩沖液補足（1.5mL），反應啟動后，用紫外分光光度計于340nm處每30s測定一個消光值，連續測定11次，取光密度最穩定減少的一段來衡量酶活性，一個GOGAT活性單位定義為在該反應條件下，每分鐘反應混合液減少1μmolNADH為一個活性單位。

式中，GOGAT活性單位為μmol·g?1·min?1，ΔA是穩定減少的那段吸光度，V1表示上清液總體積，WF表示樣品重量，t表示酶反應時間。

1.3 數據處理

利用Excel2013、SPSS16.0軟件進行制圖與分析，用Duncan檢驗進行多重比較（α=0.05）。

2 結果與分析

2.1 水氮耦合處理對葡萄葉片氮含量的影響

由圖1可見，土壤濕度對葡萄植株葉片氮含量有明顯影響，土壤濕度越小葉片吸收的氮也越少，正常供水情況下（W1，70%～80%）葉片氮含量整體水平較高（3.89～8.61g·kg?1），隨著土壤濕度的降低，W2（60%～70%）、W3（50%～60%）處理中植株葉片氮含量分別降至1.77～7.90g·kg?1、2.48～6.98g·kg?1水平，在嚴重缺水情況下（W4，30%～40%），葉片氮含量僅達1.76～3.50g·kg?1，顯著低于其它灌水處理（P＜0.05）。同時，在正常供水情況下，隨著生長時間的延長，植株葉片氮含量呈降低趨勢（圖1a），處理時間越長差異越大，但在相對缺水情況下，這種降低趨勢逐漸消失，植株葉片氮含量均處于較低水平（圖1d）。

圖1顯示，土壤中施氮與不施氮肥對葡萄植株葉片氮含量也有顯著影響，在相同的供水情況下，施氮處理（N1、N2、N3）中植株葉片氮含量均顯著高于不施氮處理（N4），而不同施氮水平間葉片氮含量的差異表現為早期（10d、20d）不顯著，后期（30d、40d）相對較顯著，W2處理中差異顯著，其它處理中相對不顯著。說明植物葉片氮含量取決于水氮耦合作用，在水分供應充足時植株葉片對氮素營養吸收能力強，其氮含量相對較高，在干旱條件下，葡萄植株受水分制約導致氮吸收能力降低，從而植株葉片氮含量下降，在相同的水分條件下，施氮多的植株葉片內含氮量高于施氮少的植株，并隨處理時間增加葉片含氮量整體呈減少趨勢。

2.2 水氮耦合對葡萄葉片氮轉運率的影響

葉片氮轉運率指觀測期間氮轉運量（氮含量減少值）占初次觀測時葉片氮含量的百分比。由表2可見，在正常水分處理（W1）下氮轉運率最高為N3處理的29.21%，比N4、N1、N2處理分別高1.22個、1.75個、1.8個百分點，在輕度（W2）和中度（W3）水分脅迫下，氮轉移率大小表現為N4>N3>N2>N1，重度水分脅迫（W4）下氮轉移率最高的為N3處理，N1處理最低，兩者相差14.4個百分點。整體而言，在輕度水分脅迫下氮的轉運率偏高，說明葡萄植株具有一定抗旱性，而水分嚴重虧缺甚至影響植物體正常生長時，高氮處理與無氮處理的氮轉運率均偏低。

圖1 不同土壤含水量條件下各施氮處理葡萄葉片氮含量的比較

注：W1、W2、W3和W4分別表示田間最大持水量的70%～80%、60%～70%、50%～60%和30%～40%水分處理。小寫字母表示處理間在0.05水平上的差異顯著性。短線表示均方誤。下同。

Note : W1, W2, W3 and W4 is 70%?80%, 60%?70%, 50%?60% and 30%?40% of maximum water capacity in the field, respectively. Lowercase indicates the difference significance among treatments at 0.05 level. The short bar is mean square error. The same as below.

表2 不同水氮處理下葡萄葉片氮轉運率的比較（%）

2.3 水氮耦合對葡萄葉片可溶性蛋白含量的影響

可溶性蛋白是植物體內可溶于水的小分子蛋白質，其含量越高說明植物氮代謝水平高。由圖2a可見，在正常水分含量W1下，N1、N2處理表現出葉片可溶性蛋白含量隨處理時間延長而增大，但N3、N4在處理30d后有略微降低趨勢，從整體看，可溶性蛋白含量最多的為高氮處理（N1），最大值出現在處理40d時，為14.47mg·g?1，最少的是無氮的N4處理。在輕度干旱處理（圖2b）中，進行N2處理的葡萄葉片可溶性蛋白含量最高，其后依次是N1、N3、N4處理，但仍分別比正常水分處理時減少了13.20%、3.10%、1.54%、4.44%。在中度干旱處理（圖2c）中，各氮素水平表現出的可溶性蛋白含量的變化趨勢一致，均為先增長后降低，其中值得注意的是，N4在處理40d時其值最低。重度干旱脅迫下（圖2d），可溶性蛋白含量最高的為N4處理，其后依次是N3、N2、N1處理，N1處理在40d時基本處于蔫死狀態，較W1處理下N1、N2、N3、N4均值分別降低71.6%、61.3%、53.0%、43.3%?？傊叩谝欢ǔ潭壬峡蓮浹a水分虧缺，但隨著水分脅迫加重增加氮素非但對植株生長沒有幫助，反而使植物所受脅迫更加嚴重，由圖2可得，W1、W2、W3和W4水分條件下的最佳施氮量分別是N1、N2、N3和N4處理。

圖2 不同水氮處理下葡萄葉片可溶性蛋白含量的比較

2.4 水氮耦合對葡萄葉片游離氨基酸含量的影響

游離氨基酸是氮代謝的中間產物，它能夠影響植物生長發育和氮同化，其含量多反映了氮代謝能力強，反之則表示弱。由圖3看出，葉片游離氨基酸含量隨處理天數增加呈現不同程度的變化趨勢（P<0.05），其中圖3a中N1處理游離氨基酸含量最高，較N2、N3、N4處理分別高出8.71%、25.25%、46.72%；由圖3b可得，在處理10d時，游離氨基酸分布表現為N2>N1>N3>N4，隨著處理時間的增加，4種氮處理下的游離氨基酸含量逐漸增加，在處理40d時，游離氨基酸分布表現為N1>N2>N3>N4，說明葡萄在生長過程中有一定抗旱性；由圖3c、3d發現，在W3、W4水分處理下的游離氨基酸含量均呈先升高后降低的趨勢，且N3和N4處理下的游離氨基酸含量顯著高于N1和N2處理。說明在水分適宜（W1）和輕度水分脅迫（W2）下，增加施氮量使游離氨基酸含量增加，中度水分脅迫（W3）下，低氮處理更能緩解水分脅迫帶來的危害，重度水分脅迫（W4）下，氮處理不能緩解水分脅迫的危害，而會造成更嚴重的后果，由圖3可得，W1、W2、W3和W4水分條件下的最佳施氮量分別是N1、N1、N3和N4處理。

2.5 水氮耦合對葡萄葉片硝酸還原酶活性的影響

葡萄葉片在生育期吸收的氮素主要形式是硝態氮，但參與氨基酸和蛋白質合成還需在硝酸還原酶（NR）催化作用下還原成銨態氮。NR是植物體內硝態氮同化的調節酶和限速酶，因此它對外界氮肥反應敏感。圖4a是正常水分處理（W1）下的情況，由圖可見，NR活性以高氮處理（N1）最高，高出N2處理15.80%，以低氮N4處理最低，較N2減少了26.55%，N1、N2、N3處理的NR活性整體隨處理時間的延長而增大，而N4呈先略微增大后減少的趨勢；圖4b中各處理的變化規律與圖4a基本一致，但斜率有顯著降低；圖4c中N1處理下的NR活性顯著降低，最高的是N3處理，仍較W1N2低10%，其次是N2處理，N1與N4差別不大；由圖4d可見，在處理40d后，N4中NR活性最高，最低的反而是N1處理。說明在不同水分條件下一定范圍內提高施氮水平可促進葉片NR活性，而施氮過量會造成氮素營養供過于求，NR增幅降低，甚至不增加反而減少，由圖4可得，W1、W2、W3和W4水分條件下的最佳施氮量分別是N1、N1、N3和N4處理。

圖3 不同水氮處理下葡萄葉片游離氨基酸含量的比較

圖4 不同水氮處理下葡萄葉片硝酸還原酶活性的比較

2.6 水氮耦合對葡萄葉片谷氨酰胺合成酶活性的影響

谷氨酰胺合成酶（GS）具有將NH4+代謝從無機氮轉化為有機氮的中心作用，是參與氨同化過程的關鍵酶。從圖5a可以看出，正常水分處理（W1）條件下，N1、N2處理GS活性隨處理時間延長呈增長趨勢，而N3、N4呈先增加后減少趨勢，在處理30d時達峰值，分別為0.27、0.23A·mg?1protein·h?1；圖5b可見，在輕度干旱（W2）下，N2處理中GS的活性較N1處理高9.21%，N3、N4處理GS活性隨著脅迫時間呈先增大后減少的趨勢，圖c、圖d分別是中度和重度水分脅迫，GS活性均隨脅迫時間增加先略微增加后降低，中度水分處理下N3表現最好，而重度水分脅迫下則是N4，說明在低灌溉量水平下低肥有助于植株NR活性的提高，肥料充足低灌水量反而抑制其活性。整體表明輕度水分脅迫（W2）對植株葉片GS活性影響較小，維持了正常植株氨同化過程；中度（W3）和重度（W4）水分脅迫下GS活性顯著低于W1、W2處理下，由于水分缺乏降低了植株氮同化能力，大量銨態氮的積累，影響植株生長。由圖5可見，W1、W2、W3和W4水分條件下的最佳施氮量分別是N1、N2、N3和N4處理。

圖5 不同水氮處理下葡萄葉片谷氨酰胺合成酶活性的比較

2.7 水氮耦合對葡萄葉片谷氨酸合成酶活性的影響

谷氨酸合成酶（GOGAT）是生成谷氨酸的催化酶，與GS構成的循環反應是高等植物氨同化的主要途徑。由圖6可看出，正常水分處理（W1）下葉片谷氨酸合成酶活性顯著高于其它水分脅迫處理，即W1>W2>W3>W4，其中圖6a中N1處理表現出的GOGAT活性最高，其曲線斜率表現出增長速率最快；由圖6b得，輕度水分脅迫（W2）條件下各處理均在脅迫30d時出現峰值，分別為0.45、0.49、0.43、0.41μmol·g?1·min?1，由圖6c可看出，在中度水分脅迫條件（W3）下，GOGAT活性最高的是N3處理，N1、N2、N4較N3分別低22.18%、20.01%、19.81%；由圖6d可以看出，在嚴重水分脅迫（W4）下，N1、N2、N3、N4表現出的GOGAT活性較低，從均值上看N4>N3>N2>N1，說明在水分嚴重缺乏的條件下并不適宜用施氮來緩解。由圖6可見，W1、W2、W3和W4水分條件下的最佳施氮量分別是N1、N2、N3和N4處理。

圖6 不同水氮處理下葡萄葉片谷氨酸合成酶活性的比較

3 結論與討論

3.1 討論

本實驗研究表明，葡萄葉片中氮含量隨水分脅迫程度加重而減少，在相同水分條件下，一方面植株葉片氮含量隨處理時間增加呈減小趨勢，這是一種稀釋現象。另一方面，植株內氮含量隨施氮量增加而增加，說明施氮可增加植株對氮的吸收，但水分虧缺則抑制植物對氮的吸收。這與向友珍等[25]對不同水氮處理下甜椒葉片氮含量的規律一致，原因是水分虧缺使氮素運輸受到影響，甚至無法滿足植株正常生長需求。就氮轉運率而言，輕度水分脅迫下氮轉運率最高，說明適度干旱更有利于葡萄植株葉片的氮轉運。

在調節氮代謝過程中，硝酸還原酶（NR）是作物吸收利用NO3?過程中首個關鍵酶，直接調節NO3?的還原；谷氨酰胺合成酶（GS）和谷氨酸合酶（GOGAT）構成的循環是NH4+同化的主要途徑。NR、GS、GOGAT是高等植物氮吸收、同化和循環的主要酶系。本研究發現，葡萄幼苗葉片NR活性在輕度水分脅迫下有一定提高，這與孫園園等[26]對水稻的研究結果一致，說明葡萄具有一定抗旱性，在持續中度和重度水分脅迫下，NR活性呈顯著降低，且峰值隨著水分脅迫程度加重而不斷提前，這與楊夕等[27]的研究結果一致，因為NR是氮代謝過程中的第一個酶，對水分變化極其敏感，水分脅迫使葉片NR活性得到快速響應；GS、GOGAT活性隨水分脅迫加重呈不同程度降低，因水分作為吸收和運輸營養的主要媒介，它的虧缺使進入葡萄植株內的NO3?-N和NH4+-N減少，隨之氮代謝受到影響，相應的GS和GOGAT活性也大幅降低，這與白澤晨等[28]的研究結果一致，但周衛等[29]在對水稻幼苗研究時發現輕度水分脅迫不影響植株內氨代謝，與本實驗研究結果不符，可能原因一是不同研究對象抗旱性不同，二是實驗設置的水分脅迫程度不同，使結果帶來一定偏差，在重度水分脅迫下水稻幼苗的GS、GOGAT活性受到顯著影響與本研究結果一致。在水分適宜條件下，缺少氮肥嚴重抑制NR、GS、GOGAT活性，一定范圍內提高施氮水平可促進葡萄葉片內氮代謝，而在干旱情況下施氮過量會造成氮素營養供過于求，使NR、GS、GOGAT活性增加幅度降低，甚至減少，此時反而低氮處理更適宜葡萄植株的生長，這與張麗瑩等[14]對黃瓜葉片的研究一致。由此推測，水分適宜時增施氮肥使后期土壤中氮素含量仍較高，植物體能夠繼續吸收土壤中的氮素，進而有較強的氮素同化和轉運能力，因此，有利于延緩葉片衰老，為蛋白質、氨基酸等的積累奠定良好基礎。

游離氨基酸作為氮代謝的中間產物，可溶性蛋白質作為氮代謝的最終產物，它們的合成均在NR、GS、GOGAT等酶的共同催化下完成。可溶性蛋白質含量在一定程度上反應了氮代謝的活躍程度，也是體現植株葉片衰老的關鍵指標，而游離氨基酸是植株體內氮化物的主要存在和運輸形式，它參與氮素的吸收和同化，并與器官中蛋白質的合成和降解緊密聯系在一起。許多學者研究發現，增施氮肥可顯著提高小麥、水稻、玉米等植株葉片中游離氨基酸含量，進而促進蛋白質合成。本實驗研究表明，隨處理時間遞增，葡萄葉片游離氨基酸和可溶性蛋白質含量在W1和W2條件下大體呈增長的趨勢，并且高氮處理有利于兩者在葡萄葉片中的積累，在W3和W4條件下，高氮處理不但不能提高游離氨基酸和可溶性蛋白質含量反而使其值顯著降低，所受危害更嚴重，這可能與氮肥含量過高，引起氮素在組織內大量積累，造成植株源器官中氮代謝能力受限，以及葉片中NR、GS和GOGAT等酶活性的降低導致氮同化和合成能力下降有關，這在前人研究中得到了證實。由此進一步說明，葉片中游離氨基酸和可溶性蛋白含量能很好地表征氮素同化和轉運能力。

3.2 結論

在適宜水分條件下增施氮肥葡萄葉片氮代謝增強，為葡萄生育后期物質運轉奠定了良好基礎；植株遭遇輕度水分脅迫時，增施氮肥在一定程度上能減輕干旱帶來的脅迫。在水分嚴重虧缺條件下，減少施氮更有利于植株生長。研究對設施葡萄實際生產中的推薦施氮量進行綜合評估認為，在輕度水分脅迫（W2）下，施用N1（25.5g·m?2）能有效緩解干旱帶來的危害；在中度水分脅迫（W3）下，施用N3（8.5g·m?2）較好；在重度水分脅迫（W4）下，施氮處理已不能緩解干旱帶來的危害。按照以上施肥方案進行實際操作，既能有效利用氮肥來緩解干旱脅迫，也能有效避免肥料的浪費，實現低投入，高產出，給實際生產提供重要指導。但本實驗只就氮素水平做了一定研究，而未將氮素形態以及與其它肥料配施對氮代謝酶相關影響考慮其中，針對氮磷鉀肥影響下的葡萄植株生理響應機制有待進一步研究。

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Effect of Water and Nitrogen Coupling on Nitrogen Metabolism Enzyme Activities in Grapevine Seedling Leaves

LI Jia-shuai1, YANG Zai-qiang1,2, WANG Ming-tian3, WEI Ting-Ting1, ZHAO He-li1, JIANG Meng-yuan1, Sun Qing1, HUANG Qin-qin1

(1. Collaborative Innovation Center on Forecast and Evaluation of Meteorological Disasters, Nanjing University of Information Science & Technology, Nanjing 210044, China；2. Jiangsu Provincial Key Laboratory of Agrometeorology, Nanjing 210044；3. Sichuan Meteorological Bureau, Chengdu 610071)

In order to study the effect of water and nitrogen coupling on nitrogen metabolism of grape leaves at seedling stage and the formulation of optimal nitrogen application, the annual "Hongti" grape was used as the research material. A comprehensive design of four levels of water and nitrogen in the greenhouse was used to carry out the experiment under the artificial environment control method. The water treatments were as follows: normal irrigation W1 (70%?80% of maximum water capacity in the field), mild stress W2 (60%?70%), moderate stress W3 (50%?60%) and severe stress (30%?40%).The levels of nitrogen application were as follows:1.5 times recommended fertilization N1 (pure nitrogen 25.5g·m?2), normal recommended fertilization N2(17g·m?2), 0.5 time recommended fertilization N3(8.5g·m?2), no nitrogen fertilizer N4(no nitrogen application).The treatment time was 10, 20, 30, 40 days. The results showed that the content of nitrate reductase (NR), glutamine synthetase (GS),glutamine-oxoglutarate aminotransferase(GOGAT), soluble protein and free amino acid increased with the increase of nitrogen application when moisture conditions were appropriate. When drought stress was mild, increased application of nitrogen fertilizer can alleviate drought stress .When drought stress was severe, high nitrogen treatment reduced the activities of nitrogen metabolism enzymes , the content of free amino acids and soluble proteins in the leaves of the grape. The nitrogen content in the leaves of grape always decreased with the increase of treatment time. Under mild water stress, the nitrogen transport rate was higher. When the water stress was severe, the nitrogen transport rate of treatment under high nitrogen and no nitrogen were lower. Finally, under the suitable water conditions (W1) and mild water stress (W2), the nitrogen metabolism ability of grape leaves under N1 (purified nitrogen 37.5g·m?2) was the highest. Under moderate water stress (W3) and severe water stress (W4), N3 (pure nitrogen 12.5g·m?2) and N4 (no nitrogen application) had the highest nitrogen metabolism capacity. The research results provide a theoretical basis for the prevention and control of drought disasters in the actual production of grapes, which can effectively alleviate the harm caused by water stress, and avoid the waste of fertilizer in production, so as to achieve less fertilizer efficiency.

Grape; Nitrogen metabolism; Water and nitrogen stress; Nitrogen content; Optimum N application

10.3969/j.issn.1000-6362.2019.06.004

收稿日期：2018?11?06

通訊作者。E-mail：yzq@nuist.edu.cn

江蘇省科技支撐項目（BE2015693）；四川省重點實驗室科技發展基金項目（省重實驗室2018-重點-05）

李佳帥（1993?），女，研究方向為設施農業氣象。E-mail：596993884@qq.com

李佳帥,楊再強,王明田,等.水氮耦合對苗期葡萄葉片氮素代謝酶活性的影響[J].中國農業氣象,2019,40(6):368-379