獨角石斛組培快繁技術

陳 春

(福建省林業科技試驗中心，福建 南靖 363600)

石斛蘭屬(Dendrobium)為蘭科(Orchidaceae)中的三大屬之一，有近2 000種原生種，主要分布在亞洲的熱帶、亞熱帶地區及大洋洲[1]。石斛蘭花色鮮艷、擺放觀賞時間長且品種繁多，園藝及觀賞價值較高。獨角石斛是石斛蘭的一個小型種，其唇瓣反轉似犀牛角，花瓣橙紅色，唇瓣上布有深橙紅色網紋。通常利用觀賞石斛的植株側芽進行分株繁殖以獲得種苗。但蘭科植物不易發芽，分株繁殖慢且生長不一致，因此，組培技術在觀賞石斛上的應用前景廣闊[2-3]。近年來，國內已有石斛蘭組培方面的研究，大多以其種子作為外植體，較少以側芽作為外植體[4-11]。本試驗以獨角石斛側芽為外植體，對組培過程進行系統研究，以期為觀賞石斛組培快繁及規?；a提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為栽培于福建省林業科技試驗中心五板橋基地溫室中的2年生獨角石斛，取其生長健壯、無病蟲害的當年生側芽作為外植體。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體的消毒與誘導 在天氣晴朗的下午，剪取生長健壯、無病蟲害獨角石斛側芽為外植體。將剪下的側芽用0.1%洗衣粉浸泡5 min左右，之后切成5 cm莖段，用自來水沖洗3～5遍，放置于超凈工作臺上。用體積分數為75%酒精溶液消毒 30～60 s，再用HgCl2消毒15～20 min，最后用無菌水沖洗3～5遍，切割成2～3 cm莖段，接種到誘導培養基上。誘導培養基以MS+0.2 mg·L-1NAA+30 g·L-1蔗糖+7.5 g·L-1瓊脂為基本培養基，并添加了不同質量濃度的6-BA。6-BA是石斛蘭芽誘導較為重要的生長調節劑，適宜的濃度有利于不定芽的增殖。6-BA分別設置為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg·L-1，誘導培養基相應代號為Y1～Y6。每種培養基接種30 瓶，每個培養瓶接種1個外植體，重復3次。培養15 d后統計污染情況，培養30 d后統計不定芽的誘導率。

污染率/%=(污染的外植體瓶數/接種瓶數)×100

誘導率/%=(外植體分化瓶數/無菌瓶數)×100

表1 獨角石斛增殖培養試驗的因子水平表Table 1 Factors and levels of proliferation culture test

1.2.2 不定芽的增殖培養 將誘導培養獲得的不定芽切下，接到繼代增殖培養基中進行培養。6-BA和KT有利于不定芽的增殖，少量NAA有利于不定芽的生長。為此，以MS+30 g·L-1蔗糖+7.5 g·L-1瓊脂為基本培養基，分別添加不同質量濃度的6-BA、KT、NAA(表1)。利用L9(34)正交試驗，分析不同激素水平對獨角石斛叢生芽增殖系數的影響。每個處理接種30瓶，每瓶接種1個不定芽，3次重復。45 d后統計叢生芽的增殖及生長情況。

1.2.3 不定芽的壯苗生根培養 將繼代增殖培養獲得的3 cm以上的叢生芽切下，接種到壯苗生根培養基中培養。生長素NAA和IBA對不定根的誘導有促進作用。本試驗以1/2MS+0.5 g·L-1AC+30 g·L-1蔗糖+7.0 g·L-1卡拉膠為基本培養基，添加50 g·L-1土豆、50 g·L-1香蕉泥， NAA分別設置為0、0.2、0.4、0.6、0.8 mg·L-1，IBA為0.5 mg·L-1，壯苗生根培養基代號為R1～R5。比較不同質量濃度NAA及IBA對獨角石斛生根情況的影響。每種培養基接種30瓶，每瓶接5叢， 3次重復，45 d后統計生根苗生長狀況。

1.2.4 組培苗的移栽 當壯苗生根培養獲得的生根苗長至5 cm以上，將瓶苗煉苗15 d后即可移栽。清洗組培苗根部的殘留培養基，再用質量分數為0.1%多菌靈消毒15 s，之后種植在消毒處理過的水苔及樹皮屑基質中，于溫室大棚中培育。由于水苔和樹皮屑的透氣性和保水性好，適合石斛蘭的移栽，本試驗設置3個處理：T1為水苔；T2為水苔與樹皮屑以1∶1混合；T3為樹皮屑。每種培養基質種植30叢組培苗，3次重復。栽培期間應注意遮蔭、噴水保濕，移栽45 d后觀察小苗的移栽成活率及生長情況。

1.2.5 培養條件 組培培養室溫度為23～25 ℃，光照周期為10 h·d-1，光照強度為2 000 lx；溫室大棚濕度控制在70%～85%，溫度25～30 ℃。

2 結果與分析

2.1 6-BA質量濃度對獨角石斛不定芽誘導的影響

外植體培養15 d左右，不定芽開始萌發，30 d左右可統計不定芽的誘導率。由表2可知，不同質量濃度6-BA對不定芽的誘導率存在顯著差異。 當 6-BA<1.0 mg·L-1或>2.0 mg·L-1時，不利于不定芽的誘導;當 6-BA為2.0 mg·L-1時，誘導率最高，達95.5%，不定芽生長健壯，葉片綠色；上升至3.0 mg·L-1時，誘導率降低，不定芽出現玻璃化現象。因此，以獨角石斛側芽為外植體可誘導出不定芽，在基礎培養基MS中添加2.0 mg·L-16-BA和0.2 mg·L-1NAA，不定芽的誘導效果最好。

表2 6-BA質量濃度對獨角石斛外植體誘導的影響1)Table 2 Effects of 6-BA concentrations on the inductions of D.unicorneum explants

1)同列數值后附不同大小寫字母者分別表示差異達0.01、0.05顯著水平。

2.2 不同激素對獨角石斛不定芽增殖的影響

圖1 獨角石斛繼代瓶苗Figure 1 Subculture seedlings of D.unicorneum

不定芽接種到繼代增殖培養基后，其增殖速度快，45 d后可長成叢狀(圖1)。方差分析表明，對獨角石斛增殖系數影響最大的因素是6-BA，其次是KT，這兩個因素的P值均為0，說明6-BA和KT對增殖系數的影響極顯著(表3)。NAA對獨角石斛增殖系數的影響不顯著。

正交試驗方差分析顯示，5號獨角石斛增殖系數(4.78)最大，在0.01水平上顯著差異于其他處理的培養基(表4)。因此，選擇獨角石斛的最適增殖培養基為：MS+2.0 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1KT+0.4 mg·L-1NAA+30 g·L-1蔗糖+7.5 g·L-1瓊脂。

表3 正交設計方差分析表Table 3 ANOVA Table of orthogonal design

2.3 培養基對獨角石斛生根誘導的影響

當不定芽長至3 cm時，將其切下并轉接到培養基上，經25 d的生根誘導培養，可獲得生根組培苗(圖2)。由表5可知，當NAA<0.4 mg·L-1時，不定根的生根率和生根條數均隨著NAA濃度的提高而增加，R1～R3處理生根條數呈極顯著差異；當NAA為0.4 mg·L-1時，生根率達100%，根數達5.7條；當NAA>0.4 mg·L-1時，對不定根的誘導反而不利。由表5還可知，僅添加IBA或NAA時，生根率及生根條數都極顯著低于添加NAA+IBA的組合。因此，最佳生根培養基為：1/2 MS+0.4 mg·L-1NAA+0.5 mg·L-1IBA+0.5 g·L-1AC+50 g·L-1土豆+50 g·L-1香蕉泥+20 g·L-1蔗糖+7.0 g·L-1卡拉膠。

表4 獨角石斛正交試驗方差分析表Table 4 Variance analysis of D.unicorneum using orthogonal test

圖2 獨角石斛生根苗Figure 2 Rooting seedlings of D.unicorneum

表5 不同激素組合對獨角石斛生根的影響1)Table 5 Effects of different hormone combinations on the rooting of D.unicorneum

1)同列數值后附不同大小寫字母者分別表示差異達0.01、0.05顯著水平。

2.4 基質對獨角石斛移栽成活率的影響

1)同列數值后附不同大小寫字母者分別表示差異達0.01、0.05顯著水平。

從表6可見，不同基質對獨角石斛組培苗的移栽成活率有顯著影響。以水苔作為基質時，成活率(90.5%)最高且莖粗壯、葉色深綠，苗長勢好(圖3)；以水苔∶樹皮屑為1∶1作為基質時，成活率較低；以樹皮屑為基質，成活率最低且長勢較弱。因此，選擇水苔作為獨角石斛的移栽基質。

圖3 移栽45 d的獨角石斛組培苗Figure 3 Seedlings of D.unicorneum transplanted for 45 d

3 小結

目前獨角石斛尚未在市場上大量銷售，關于其組培技術的報道較少。本試驗以獨角石斛側芽作為外植體誘導不定芽，篩選出了最佳繼代增殖培養基、生根培養基及栽培基質，以期為其產業化生產提供參考。不定芽誘導的最適培養基為：MS+2.0 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA+30 g·L-1蔗糖+7.5 g·L-1瓊脂，誘導率最高，達95.5%；叢生芽的最適增殖培養基為：MS+2.0 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1KT+0.4 mg·L-1NAA+30 g·L-1蔗糖+7.5 g·L-1瓊脂，增殖系數達4.78；最適生根培養基為：1/2 MS+0.4 mg·L-1NAA+0.5 mg·L-1IBA+0.5 g·L-1AC+50 g·L-1土豆+50 g·L-1香蕉泥+20 g·L-1蔗糖+7.0 g·L-1卡拉膠，生根率達100%，苗生長健壯；組培苗經15 d煉苗后，移栽到水苔基質中，45 d后成活率達90.5%。

本研究表明，以MS為基本培養基適合石斛叢生芽的增殖繼代培養，這結果與蒙陽等[12]研究相一致。為了提高獨角石斛移栽成活率，本試驗通過在生根培養基中添加土豆、香蕉泥進行邊生根邊壯苗，提高了組培苗移栽成活率，與高燕等[13]研究相一致。