石菖蒲超臨界萃取物對抑郁模型大鼠行為學的影響

王小萌,吳全娥,石 鑫,韓云鵬

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，哈爾濱 150036； 2.河北中醫(yī)學院基礎(chǔ)醫(yī)學院，石家莊 050200； 3.河北中醫(yī)學院國醫(yī)堂，石家莊 050200)

抑郁癥是常見的精神性障礙疾病，該病發(fā)病率高，嚴重危害患者的身心健康，對其生活學習能力有較大影響，不僅降低患者生活質(zhì)量，嚴重時患者甚至會出現(xiàn)自殺現(xiàn)象[1-2]。抑郁癥不僅給患者家庭的精神和經(jīng)濟帶來巨大的壓力和負擔，也給社會造成損失和經(jīng)濟負擔。目前，抑郁癥已成為我國未來需重點防控的疾病之一。石菖蒲是天南星科菖蒲屬植物，性味辛、苦、溫，歸心、胃經(jīng)，具有開胃化濕、開竅醒腦、益智安神的作用。臨床研究表明，石菖蒲可以保護中樞神經(jīng)系統(tǒng)和抗抑郁的作用[3-4]。但以往石菖蒲在藥用時主要以水煎劑的形式使用，這種方法不僅耗時，對草藥中有效成分的提取率也降低，而且還會將植物中含有的重金屬濃縮到藥劑中，在治病的同時又會致病。超臨界法降萃取和分離同時進行，對中藥中有效成分的萃取能力強，10 min就可以將產(chǎn)品分離，2～4 h可將有效成分完全提取，工藝簡單、操作方便，不需蒸發(fā)濃縮等工序。超臨界萃取得到的產(chǎn)品質(zhì)量高，天然植物有效成分高度富集并能得到較好的保存，具有巨大的實用價值。本實驗在我國傳統(tǒng)醫(yī)學理論的基礎(chǔ)上結(jié)合現(xiàn)代抗抑郁藥物篩選手段，研究石菖蒲超臨界萃取物對抑郁模型大鼠行為學的影響，以期為石菖蒲在抗抑郁治療中的應用提供科學參考。

1 材料與方法

1.1實驗材料 實驗選用200只健康SD雄性大鼠，體重190～210 g，平均(200±7) g，由黑龍江中醫(yī)藥大學提供(合格證號：SCK黑2015007)，在飼舍內(nèi)進行適應性飼養(yǎng)，溫度為20～24 ℃，平均(22.1±0.8) ℃，每天8:00～20:00為光照時間，自由飲水和飲食。石菖蒲由黑龍江中醫(yī)藥大學提供，經(jīng)50 ℃烘干、粉碎后過40目篩制成原粉。

1.2實驗方法

1.2.1抑郁模型的建立 在預飼養(yǎng)7 d后，采用隨機數(shù)字法選擇大鼠120只，采用慢性不可預知溫和應激(chronic unpredictable mild stress，CUMS)法建立抑郁模型，主要包括45°角傾斜鼠籠、持續(xù)震蕩鼠籠5 min、持續(xù)禁食24 h、持續(xù)禁水24 h、34 ℃高溫飼養(yǎng)24 h、冰水泳5 min、夾尾1 min、0.3 A電流電擊足底、晝夜不節(jié)律和束縛等應激刺激，造模全程每天隨機給予1種應激刺激3次，連續(xù)刺激21 d，以糖水偏好度評分顯著低于正常大鼠認定為造模成功[5]。在造模期內(nèi)保持與預飼養(yǎng)期相同的飼養(yǎng)方式，在實驗開始第1天給藥前對造模大鼠進行糖水偏愛度測試，剔除結(jié)果異常的造模大鼠后，選擇糖水測試評分接近且顯著低于正常大鼠80只進行后續(xù)實驗，并繼續(xù)每天給予CUMS法刺激。

1.2.2藥液的制備 將石菖蒲原粉裝入超臨界萃取釜中，于25 MPa、50 ℃下用超臨界CO2提取設備提取2.5 h，得到黏稠液態(tài)提取物，回收率為4.8%，收集提取液后用超純水按0.1 g/mL配制成藥液。

1.2.3設計和分組 在未造模的正常大鼠中采用隨機數(shù)字法選取20只作為空白組，80只造模大鼠根據(jù)實驗處理方法不同分為模型組、低劑量組、中劑量組和高劑量組，每組20只，各給藥治療組分別按藥物/體重比為0.05 g/100 g、0.1 g/100 g、0.15 g/100 g給予石菖蒲提取物藥液，以灌胃給藥治療第1天為實驗第1天，全程共28 d。

1.2.4檢測指標和方法

1.2.4.1一般狀態(tài)評價 在實驗第1天開始，每天觀察大鼠的體重、進食、自主活動情況、體毛狀態(tài)和對外界環(huán)境變化的反應情況。

1.2.4.2大鼠的糖水偏愛測試 在實驗開始第1天和第28天對大鼠進行糖水偏愛度測試。具體方法：在測試開始前訓練大鼠適應含有1%蔗糖的飲水，糖水測試實驗期間保持飼舍的安靜，訓練大鼠適應含糖飲水，每籠同時放置2個水瓶，第1個24 h，2瓶均裝有1%蔗糖水，隨第2個24 h，分別裝普通飲用水和含有1%蔗糖的水，位置隨機。適應性訓練后，將大鼠以每籠1只進行分籠飼養(yǎng)，并禁食禁水24 h，然后在鼠籠隨機位置放入1瓶1%的蔗糖水和1瓶普通飲用水，記錄1 h瓶內(nèi)液體的消耗量，排除飲水瓶滴漏所致的液體損耗量。

糖水偏愛度(%)=1%蔗糖水消耗量/(1%蔗糖水消耗量+普通飲用水消耗量)×100%。

1.2.4.3大鼠的強迫游泳實驗 在給藥第28天強迫大鼠進行游泳測定，每次進行糖水偏愛測試后，在同一安靜飼舍內(nèi)對各組大鼠進行強迫游泳實驗，實驗開始前對大鼠禁食12 h，實驗開始后將大鼠置于水深60 cm，直徑約40 cm，水溫(25±5) ℃的玻璃容器內(nèi)，讓大鼠強迫游泳10 min，觀察第4～7分鐘內(nèi)大鼠漂浮不動的時間，取出大鼠吹干后放回鼠籠，12 h后更換玻璃容器中的水，在原條件下再次重復該實驗，合并兩組數(shù)據(jù)后取平均值。

1.2.4.4大鼠的曠場實驗 在給藥第28天對大鼠曠場行動距離進行觀察。將邊長為80 cm×80 cm的木板，用黑筆按20 cm×20 cm畫成16個小正方格，然后用40 cm高的木板做成圍欄，制成大鼠的曠場實驗設備，并在圍欄上邊緣的中央部位安裝攝像機，記錄大鼠運動情況。實驗開始前3 d，每天在實驗環(huán)境中對大鼠進行撫摸，實驗開始后，將大鼠逐只放置于實驗裝置的中央格子內(nèi)，實驗人員迅速離開，保持室內(nèi)安靜，記錄5 min內(nèi)大鼠的水平運動和垂直運動的得分情況，記錄結(jié)束后，取出大鼠，打掃實驗曠場，并用低濃度乙醇去除大鼠的殘留氣味。以大鼠至少三只腳跨入同一方格內(nèi)算一格，大鼠每跨過一個底面方格記1分。以大鼠雙上肢離開地面2 cm以上為標準記錄大鼠垂直活動得分，每離開一次記1分。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠一般狀態(tài)評價 在實驗全程中，空白組體重無顯著變化，進食和自主活動情況正常，毛色有光澤，對外界環(huán)境變化有一定反應，但不會出現(xiàn)驚恐現(xiàn)象。模型組大鼠隨實驗時間延長，表現(xiàn)為瘦弱、食欲下降、易倦怠、自主活動減少、體毛枯燥無光澤，并會出現(xiàn)易被外界聲音或光線變化驚嚇。通過灌胃石菖蒲提取物藥液后，各給藥組大鼠出現(xiàn)瘦弱和易倦怠情況有所緩解，食欲上升，自主活動增加，體毛逐漸恢復光澤。

2.2各組大鼠糖水偏愛度的比較 實驗第1天，模型組和低、中、高、劑量組大鼠糖水偏愛度低于空白組(P<0.05)，但模型組和各給藥組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；實驗第28天，模型組和低、中、劑量組大鼠糖水偏愛度低于空白組(P<0.05)，低、中、高劑量組高于模型組(P<0.05)，中、高劑量組高于低劑量組(P<0.05)，但中劑量組和高劑量比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

2.3各組大鼠游泳不動時間、水平和垂直得分比較 在給藥第28天，模型組和低、中劑量組游泳不動時間長于空白組(P<0.05)，低、中、高劑量組少于模型組(P<0.05)，中、高劑量組少于低劑量組(P<0.05)，高劑量組少于中劑量組(P<0.05)；模型組和低劑量組水平得分低于空白組(P<0.05)，低、中、高劑量組高于模型組(P<0.05)，但各給藥組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；模型組和低劑量組垂直得分低于空白組(P<0.05)，低、中、高劑量組顯著高于模型組(P<0.05)，高劑量組高于低劑量組(P<0.05)，但低劑量組和中劑量組、中劑量組和高劑量組組間比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

a與空白組比較，P<0.05；b與模型組比較，P<0.05；c與低劑量組比較，P<0.05

表2 各組大鼠游泳不動時間、水平和垂直得分比較

a與空白組比較，P<0.05；b與模型組比較，P<0.05；c與低劑量組比較，P<0.05；d與中劑量組比較，P<0.05

3 討 論

成功的動物模型應具備模擬行為表現(xiàn)的能力和對藥效具有較好預測性，疾病模型成功與否會直接影響研究成果的可靠性和科學性。但與其他疾病的模型不同，抑郁癥的產(chǎn)生與環(huán)境、心理等因素有密切關(guān)系，而且動物模型只能夠模擬出人類抑郁某些狀態(tài)[6]。因此，找到一個與人類抑郁狀態(tài)完全一致的動物模型并不容易。CUMS模型建立方法是運用慢性、低水平的刺激動物產(chǎn)生抑郁狀態(tài)，這種方法與人類發(fā)生抑郁的機制更加接近，而且CUMS模型在模擬快感缺乏的狀態(tài)方面可持續(xù)數(shù)個月，基本符合抑郁模型的科研要求[7]。通過CUMS方法建立的抑郁模型能夠表現(xiàn)出一系列與人類抑郁患者類似的行為障礙表現(xiàn)，且這些行為障礙可以通過模型動物對糖水偏愛度是否顯著降低來評價模型建立成功與否[8]。本實驗選用CUMS模型，在全部過程中實隨機使用不同類型的刺激方法，使動物無法預測刺激的發(fā)生，建立抑郁大鼠模型，并在實驗第1天，以糖水偏好度篩選造模成功大鼠。

對獎勵反應出現(xiàn)下降的現(xiàn)象屬于快感缺乏癥狀是抑郁癥的重要特征之一。目前，多數(shù)研究采用糖水偏愛度實驗作為衡量抑郁模型動物快感缺乏癥狀的有效客觀指標[9]。研究表明，在建立抑郁模型后，實驗動物對糖水的消耗量顯著下降，說明實驗動物對獎勵的反應出現(xiàn)下降[10]。有研究指出，抑郁模型動物對糖水的消耗量下降是因為禁食和禁水后其生理代謝發(fā)生變化所致，糖水消耗度的下降綜合反映了饑餓、快感缺乏和體重變化的協(xié)同作用[11]。本實驗通過對大鼠一般狀況的觀察發(fā)現(xiàn)，在造模后大鼠表現(xiàn)出瘦弱，食欲下降，對自主活動的興趣不大，也證明了糖水的消耗度與大鼠一般狀況存在協(xié)同作用。還有研究指出，人們在患有抑郁癥后，出現(xiàn)的快感缺乏、興趣缺失和運動遲緩等癥狀與中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的獎勵系統(tǒng)功能受到損傷有關(guān)[12]。本實驗結(jié)果表明，與空白組大鼠相比，模型組的偏愛度顯著下降，表現(xiàn)出對1%蔗糖水獎勵刺激的低敏感性，這種情況與人類抑郁癥的快感缺乏的情況類似。在給予抑郁大鼠灌胃含有石菖蒲超臨界萃取物的藥液28 d后，在總飲用水物顯著差異的情況下，大鼠對糖水的偏愛度顯著提高，說明抑郁型大鼠所出現(xiàn)糖水偏愛度下降的情況，已經(jīng)與禁水導致的饑渴無關(guān)，而是與抑郁大鼠對獎勵的反應能力出現(xiàn)變化有關(guān)。本實驗的研究結(jié)果也證明，給大鼠按體重比為0.1 g/100 g和0.15 g/100 g的灌胃石菖蒲超臨界萃取物可以有效改善抑郁型大鼠出現(xiàn)的快感缺失的情況。

強迫游泳實驗是利用動物在不能逃出惡劣環(huán)境的情況下，所產(chǎn)生的絕望行為而設計的一種負性應激實驗。在該類型實驗中，抑郁動物模型被強迫置于一個裝滿水的有限的空間內(nèi)，強迫其進行游泳，在初期動物會對該情況表現(xiàn)出劇烈掙扎的行為，并試圖從這種情況中脫離，但在連續(xù)性失敗后，抑郁動物模型則會選擇放棄，保持靜止不動狀態(tài)[13]。研究證明，在強迫游泳實驗中，抑郁動物模型因在逃避游泳失敗后所表現(xiàn)出來的絕望行為或在面對應激刺激時放棄主動積極應對后所形成的被動消極行為而采取保持靜止不動狀態(tài)[14]。研究指出，抑郁模型動物出現(xiàn)的這種絕望或消極行為與人類受到負性心理應激刺激誘導后所發(fā)生的抑郁癥狀十分相似[15]。強迫游泳實驗中的動物模型出現(xiàn)不動狀態(tài)的持續(xù)時間可以用來作為抑郁癥的行為學評價指標。臨床研究證明，石菖蒲能有效治療抑郁癥患者的絕望行為，因此，強迫游泳實驗廣泛運用于抗抑郁藥物的篩選[16]。抑郁型動物的研究也表明，石菖蒲水煎劑能有效縮短抑郁動物強迫游泳時的不動時間[17]。對石菖蒲主效成分之一的細辛醚的研究表明，細辛醚能顯著緩解抑郁型小鼠強迫游泳的不動時間[18]。在給藥治療的第28天，模型組大鼠強迫游泳不動時間顯著高于空白組，說明在建模后抑郁型大鼠表現(xiàn)出明顯的絕望消極行為，而在給予抑郁型大鼠石菖蒲超臨界萃取物灌胃治療后絕望消極行為得到顯著改善，而且這種治療作用與治療劑量表現(xiàn)出一定的依賴性，經(jīng)高劑量的萃取物藥液治療后，大鼠在強迫游泳實驗中所表現(xiàn)出的行為與空白組比較差異無統(tǒng)計學意義。因此，強迫游泳實驗證明，石菖蒲超臨界萃取物藥液能有效改善抑郁型大鼠的絕望消極行為。

曠場行動得分實驗將一定面積曠場劃分出不同的方格區(qū)域。實驗動物在這種新環(huán)境下會表現(xiàn)出由奮、探索再到適應的一系列行為過程。正常的動物在適應新環(huán)境的過程中會表現(xiàn)出行動活躍、四處走動等現(xiàn)象，此時動物在曠場內(nèi)水平跨越多少個方格和抬頭觀察四周環(huán)境的次數(shù)會反映其興奮程度。研究表明，抑郁型大鼠在出現(xiàn)快感缺乏或其他抑郁癥狀后運動能力及社會交往能力均會出現(xiàn)下降現(xiàn)象，對新環(huán)境進行探索行為的能力和侵犯攻擊的能力也會出現(xiàn)下降現(xiàn)象[19]。因此，曠場實驗能客觀反映抑郁型大鼠對新鮮環(huán)境的好奇程度、探索能力及其對自身情況的關(guān)注，對動物的跨越方格次數(shù)和抬頭觀察環(huán)境次數(shù)進行評分能更能客觀、直接地反映實驗動物的興奮程度，從而判斷大鼠的抑郁情況是否發(fā)生變化[20-21]。在本實驗中，模型組大鼠曠場水平運動得分和垂直運動得分顯著低于空白組，說明建模后大鼠的活動能力出現(xiàn)了障礙，對新鮮環(huán)境的好奇度和探索能力也下降，對其自身的關(guān)注度也有所下降。在對抑郁型大鼠給予石菖蒲超臨界萃取物灌胃治療后，大鼠的曠場水平運動得分和垂直運動得分顯著提高，并表現(xiàn)出與藥物劑量呈正相關(guān)。說明石菖蒲超臨界萃取物對抑郁大鼠的運動能力、對新環(huán)境的好奇度等行為有顯著的治療效果。

綜上所述，在灌胃石菖蒲超臨界萃取物藥液后，抑郁型大鼠的行為癥狀得到不同程度的改善，而且這種改善具有一定的劑量依賴性。說明石菖蒲超臨界萃取物可以有效改善抑郁型大鼠的行為學的病征。