苦瓜白粉病的生物防治及病程代謝物質(zhì)含量變化

周 游 汪 軍 楊臘英 郭立佳 梁昌聰 劉 磊 黃俊生

（中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南海口 571101）

苦瓜白粉病主要由單絲殼白粉菌（Sphaerotheca fuliginea）引起，葉片正面或者背面在發(fā)病初期形成白色粉斑，隨著病情發(fā)展，病斑連成片，并逐漸褪綠變黃直至變褐干枯，葉片光合作用降低，最終引起植株衰弱死亡，縮短采收期。該病在苦瓜整個(gè)生育期均可發(fā)生，尤其在高溫高濕條件下發(fā)生最為嚴(yán)重（陳燕瓊，2010）。目前生產(chǎn)上主要使用化學(xué)農(nóng)藥進(jìn)行防治（魏林 等，2016），隨著全社會(huì)對(duì)環(huán)境安全及食品品質(zhì)要求的不斷提高，化學(xué)農(nóng)藥減量使用、高效生物藥劑作為化學(xué)農(nóng)藥的替代產(chǎn)品正受到越來越多的重視，有益微生物防治植物病害獲得長(zhǎng)足進(jìn)展，其中芽孢桿菌是一類應(yīng)用廣泛的生防微生物，能有效防治多種植物病害（Chen et al.，2009；Shrestha et al.，2016；Xu et al.，2016）， 其主要的防病機(jī)制為營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)，產(chǎn)生拮抗物質(zhì)，寄生和誘導(dǎo)植物抗性等（黃曦 等，2010；Beneduzi et al.，2012）。

前人研究表明，芽孢桿菌作用于植物后能引起植物防御酶、脯氨酸和丙二醛等物質(zhì)的改變，而這些改變被視為是芽孢桿菌誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性的原因（Chandrasekaran & Chun，2016；Elanchezhiyan et al.，2018）。但是，不僅僅是芽孢桿菌能誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性，病原菌侵染寄主植物后也能產(chǎn)生類似效應(yīng)。例如，梨葉片和蘋果枝條被病原菌侵染后水楊酸和木質(zhì)素的含量明顯提高，由此增強(qiáng)了梨和蘋果對(duì)病原菌的抗性（張海娥 等，2014；劉斐 等，2015）。抗白粉病的苦瓜品種感染白粉病后，通過提高葉綠素、抗壞血酸和可溶性糖含量以及增強(qiáng)過氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）和抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性來提高抗病性，這些變化的物質(zhì)是評(píng)價(jià)苦瓜白粉病抗性的最佳指標(biāo)（田麗波 等，2015）。目前，針對(duì)某些抗性相關(guān)酶，例如超氧化物歧化酶（SOD）、POD和PPO等，以及茉莉酸、水楊酸、綠原酸和丙二醛等物質(zhì)在植物與生防菌或病原菌作用過程中的變化情況已有大量報(bào)道，但是鮮見從代謝組層面研究苦瓜感染白粉病后代謝物質(zhì)含量的變化情況。代謝物的變化可視為生物體對(duì)外界環(huán)境變化的應(yīng)答，對(duì)代謝物的分析能夠探明特定條件下的生物細(xì)胞狀態(tài)（Zushi & Matsuzoe，2015；Eloh et al.，2016）。

有鑒于此，本試驗(yàn)采用枯草芽孢桿菌BLG010作為生防菌株，探明其對(duì)苦瓜白粉病的防治效果。同時(shí)，通過分析苦瓜感染白粉病后代謝物質(zhì)含量的變化，發(fā)現(xiàn)了3種有機(jī)酸、2種氨基酸和2種糖類物質(zhì)的含量變化與苦瓜白粉病病程相關(guān)，為苦瓜抗白粉病品種篩選提供了線索，也為苦瓜白粉病防治策略提供了有力的科學(xué)支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料

生防菌株：枯草芽孢桿菌BLG010（專利號(hào)：CN102747020A）由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所提供，菌株保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No.5953。將菌株在LB平板上活化培養(yǎng)，將活化后的菌體接入含LB液體培養(yǎng)基的三角瓶中，37 ℃、180 r·min-1黑暗培養(yǎng)。2 d后，將培養(yǎng)液分裝在50 mL離心管中，8 000 r·min-1離心5 min，倒去液體；加入40 mL無菌蒸餾水，并劇烈振蕩離心管使管底的菌體分散，再次8 000 r·min-1離心5 min，倒去液體，該過程重復(fù)3次；用無菌藥品勺將離心管底部菌體挖出，用無菌蒸餾水稀釋成濃度為1×108個(gè)·mL-1的孢子懸浮液。

苦瓜白粉病菌（Sphaerotheca fuliginea）：自然菌株，采集于海南省瓊中縣灣嶺鎮(zhèn)鴨坡村自然發(fā)生白粉病的苦瓜葉片。用無菌毛筆在發(fā)病葉片上來回涂抹后，將毛筆放入裝有無菌蒸餾水的滅菌瓶中，來回振蕩沖洗毛筆上的孢子，獲得高濃度的孢子懸浮液，用無菌紗布過濾帶有孢子的蒸餾水以便濾掉雜質(zhì)，利用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡（ECLIPSE 80i，尼康，日本）下計(jì)數(shù)過濾后的蒸餾水中的分生孢子數(shù)，用無菌蒸餾水作為稀釋液將高濃度的孢子懸浮液制備成1×106個(gè)·mL-1的孢子懸浮液。

苦瓜品種為中華1號(hào)，購(gòu)自海南根果多農(nóng)業(yè)科技有限公司。

1.2 處理方式

選取外觀飽滿無瑕疵的無病苦瓜種子，用無菌蒸餾水浸種催芽后于2018年1月5日種植于裝有滅菌土的花盆中，每盆1株，將種苗放置于本所實(shí)驗(yàn)樓樓頂大棚里培養(yǎng)（位于海口市龍華區(qū)），將每8個(gè)花盆分為一組。于2018年2月9日，當(dāng)苦瓜植株長(zhǎng)至20 cm時(shí)進(jìn)行以下3個(gè)處理，每株噴35 mL，不同處理間距離7 m并用透明塑料薄膜隔離培養(yǎng)，每個(gè)處理3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)含8株苦瓜苗。

① 白粉病菌處理：在18：00后無太陽光直射時(shí)，將白粉病菌孢子懸浮液噴施于苦瓜葉片上。

② 白粉病菌+BLG010處理：在18：00后無太陽光直射時(shí)，將白粉病菌孢子懸浮液噴施于苦瓜葉片上，2 d后在同一時(shí)間段噴施BLG010孢子懸浮液。

③ 蒸餾水對(duì)照（CK）：在18：00后無太陽光直射時(shí)，將無菌蒸餾水噴施于苦瓜葉片上。

1.3 不同處理的代謝物質(zhì)GC-MS分析

分別于接種處理后8、15 d時(shí)采集3個(gè)處理的葉片，每株幼苗均采集從下往上數(shù)的第4片真葉，用于代謝組檢測(cè)，每8個(gè)葉片作為1個(gè)重復(fù)。

① 代謝物質(zhì)的提取：將苦瓜葉片在液氮中快速冷凍研磨，利用甲醇和氯仿提取代謝物，以核糖醇（0.2 mg·mL-1）作為內(nèi)標(biāo)，將提取液進(jìn)行真空冷凍干燥。

② 衍生化：在提取物中加入40 μL 甲氧基胺基鹽酸鹽吡啶溶液（吡啶含量為20 mg·mL-1），37℃、250 r·min-1搖晃 2 h，加入 70 μL N，O- 雙（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（含1% 三甲基氯硅烷），70 ℃、250 r·min-1振蕩60 min，取出樣品室溫放置30 min，過0.22 μm有機(jī)濾膜。

③ 色譜條件：Thermo TRACE1310/ ISQ? QD GC-MS，毛細(xì)管色譜柱為Thermo TG-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）。進(jìn)樣量 1 μL，不分流進(jìn)樣。載氣為高純氦氣，1.0 mL·min-1，恒流模式。升溫程序?yàn)椋撼跏紲囟?0 ℃，維持2 min，以5 ℃·min-1的速度升至300 ℃，維持1 min。進(jìn)樣口溫度設(shè)定為 250 ℃。

④ 質(zhì)譜條件：EI離子源，溫度250 ℃，電子轟擊電壓為70 eV。質(zhì)譜檢測(cè)范圍為45～600（m/z）。每0.2 s掃描一次，溶劑延遲3 min。樣品采用隨機(jī)順序連續(xù)自動(dòng)進(jìn)樣。

⑤ 數(shù)據(jù)處理：對(duì)樣品的總離子圖進(jìn)行色譜峰識(shí)別，并與NIST質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，鑒定代謝物質(zhì)的種類，使用自動(dòng)積分方法進(jìn)行積分，再對(duì)自動(dòng)積分結(jié)果進(jìn)行手動(dòng)校正，對(duì)代謝產(chǎn)物進(jìn)行定性和相對(duì)定量分析。

1.4 苦瓜白粉病病情調(diào)查和防治效果評(píng)價(jià)

接種15 d后按田麗波等（2015）的分級(jí)方法記錄發(fā)病情況，并計(jì)算病情指數(shù)和防治效果。

苦瓜白粉病病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)，無病斑；1級(jí)，少量細(xì)小模糊的白粉斑，病斑面積占整個(gè)葉面積的5%以下；3級(jí)，白粉層薄，病斑面積占整個(gè)葉面積的6%～10%；5級(jí)，白粉層較厚，病斑面積占整個(gè)葉面積的11%～20%；7級(jí)，白粉層厚，病斑面積占整個(gè)葉面積的21%～40%；9級(jí)：白粉層厚，病斑面積占整個(gè)葉面積的40%以上。

2 結(jié)果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌BLG010對(duì)白粉病的防治效果

試驗(yàn)結(jié)果表明（表1），僅接種白粉病菌的處理白粉病發(fā)生嚴(yán)重，接種15 d后病情指數(shù)高達(dá)57.16。接種白粉病菌后再噴施枯草芽孢桿菌BLG010的處理白粉病發(fā)生輕微，病情指數(shù)為6.01。噴施蒸餾水的處理未見白粉病發(fā)生。BLG010對(duì)白粉病的防治效果高達(dá)89.49%。

表1 枯草芽孢桿菌BLG010對(duì)苦瓜白粉病防治效果

圖1 苦瓜代謝物質(zhì)GC-MS總離子流色譜圖

2.2 苦瓜代謝物質(zhì)含量變化分析

各處理的GC-MS 總離子流色譜圖峰形較好（圖1），可通過峰面積計(jì)算相對(duì)含量，通過NIST標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)確認(rèn)化學(xué)結(jié)構(gòu)。經(jīng)計(jì)算后得知，甘油酸（glyceric acid）、延胡索酸（fumaric acid）、咖啡酸（caffeic acid）、甘氨酸（glycine）、L-谷氨酸（L-glutamic acid）、D-葡萄糖（D-glucose）和肌醇半乳糖苷（galactinol）這7種物質(zhì)的相對(duì)含量在不同處理間呈現(xiàn)規(guī)律性的差異（圖2、3、4）。在接種處理后8 d和15 d兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，與白粉病菌+BLG010處理和蒸餾水對(duì)照相比，白粉病菌處理的D-葡萄糖、肌醇半乳糖苷和延胡索酸含量均上調(diào)表達(dá)，而甘氨酸、L-谷氨酸、甘油酸和咖啡酸則表現(xiàn)為下調(diào)。

上述7種物質(zhì)中，在接種后8 d時(shí)肌醇半乳糖苷和延胡索酸分別是3個(gè)處理含量最高和最低的代謝物質(zhì)；在15 d時(shí)，3個(gè)處理含量最高的代謝物質(zhì)依然是肌醇半乳糖苷，而延胡索酸是白粉病菌+BLG010處理和蒸餾水對(duì)照含量最低的代謝物質(zhì)，甘氨酸則為白粉病菌處理含量最低的代謝物質(zhì)。從代謝物質(zhì)含量變化程度分析可知，8 d時(shí)，白粉病菌處理的D-葡萄糖含量分別是白粉病菌+BLG010處理和蒸餾水對(duì)照的6.499倍和2.695倍；15 d時(shí)，白粉病菌+BLG010處理和蒸餾水對(duì)照的甘氨酸含量分別是白粉病菌處理的6.291倍和6.316倍；說明D-葡萄糖和甘氨酸分別是8 d和15 d時(shí)白粉病菌處理與另外2個(gè)處理間含量變化程度最大的代謝物質(zhì)（圖2、3）。試驗(yàn)結(jié)果也表明，BLG010可以避免這7種代謝物質(zhì)含量的異常變化。

圖2 糖類物質(zhì)在3個(gè)處理間的變化

圖3 氨基酸在3個(gè)處理間的變化

圖4 有機(jī)酸在3個(gè)處理間的變化

3 結(jié)論與討論

植物在不同的生存條件下其代謝物質(zhì)的含量會(huì)發(fā)生改變，所以研究不同處理?xiàng)l件下的代謝組能探明植物響應(yīng)外界條件的特征物質(zhì)。本試驗(yàn)對(duì)白粉病菌、白粉病菌+BLG010和蒸餾水3個(gè)處理的苦瓜葉片進(jìn)行代謝組檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3種有機(jī)酸、2種氨基酸和2種糖類物質(zhì)的含量在不同處理間呈現(xiàn)規(guī)律性的差異。其中D-葡萄糖和甘氨酸分別是接種后8 d和15 d白粉病菌處理與另外2個(gè)處理間含量變化程度最大的代謝物質(zhì)。

葡萄糖參與光合作用、氮代謝和脅迫響應(yīng)等生物過程，不僅是植物生理活動(dòng)的能源物質(zhì)，也可作為信號(hào)分子參與植物生長(zhǎng)發(fā)育過程的調(diào)控（苗慧瑩等，2012；郜明泉 等，2015）。葡萄糖主要由蔗糖轉(zhuǎn)化酶（invertase，Inv）將蔗糖水解生成（羅玉，2004），在植物被微生物侵入后會(huì)產(chǎn)生積累現(xiàn)象（鄒英寧 等，2014；朱艷蕾和米麗吾葉提·阿達(dá)力，2018）。吳越（2014）的研究表明，甜橙感染黃龍病后出現(xiàn)Inv活性增加和可溶性糖累積的情況，認(rèn)為Inv活性增加是導(dǎo)致葡萄糖大量積累的主要原因。本試驗(yàn)中，白粉病菌處理的葉片中D-葡萄糖含量顯著高于白粉病菌+BLG010處理和蒸餾水對(duì)照，這可能是由于苦瓜受到白粉病菌侵染后通過調(diào)控相關(guān)酶，提高了合成葡萄糖的速度，而高含量的D-葡萄糖可作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)降低白粉病菌的侵害程度。這與劉業(yè)霞等（2011）和楊志曉等（2015）的研究結(jié)果類似，他們認(rèn)為植物受到病原菌侵染后可溶性糖含量會(huì)增加，由此加強(qiáng)滲透調(diào)節(jié)能力來抵抗病原菌的脅迫。

甘氨酸是由乙醛酸在轉(zhuǎn)氨酶作用下得到氨基生成，在光呼吸途徑中起著重要的作用（郭玉朋，2014；劉美君，2016）。甘氨酸可由絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)變成絲氨酸，為生物合成反應(yīng)提供一碳（C1）單位（馬莉和陳麗梅，2008），而絲氨酸含量的變化能影響光呼吸基因的表達(dá)節(jié)律（韓曉芳等，2016）。甘氨酸也能生成甘氨酸甜菜堿，而甘氨酸甜菜堿在植物受到外界脅迫時(shí)在體內(nèi)積累，由此提高植物對(duì)脅迫的耐受性（徐保紅和楊潔，2008；劉春 等，2013）。有研究證明外施甘氨酸能提高植物對(duì)外界脅迫的抵抗力（孫弘 等，2010；仇奕之 等，2018）。本試驗(yàn)中，苦瓜感染白粉病后甘氨酸含量下降的可能原因是，白粉病菌侵染導(dǎo)致甘氨酸合成受阻，或者是苦瓜受到侵染后為了補(bǔ)償光呼吸效率而過度消耗絲氨酸，從而使甘氨酸過量轉(zhuǎn)化為絲氨酸，導(dǎo)致甘氨酸含量下降，亦或者是苦瓜大量消耗甘氨酸用于甘氨酸甜菜堿的累積，由此來提高對(duì)白粉病菌的耐受性。

本試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，苦瓜被白粉病菌侵染后，體內(nèi)L-谷氨酸和咖啡酸含量下降。谷氨酸是植物體內(nèi)重要的氨基酸，不僅是多數(shù)氨基酸的合成前體，也是葉綠素合成的起始物質(zhì)（江勝德 等，2015），同時(shí)也是γ-氨基丁酸、脯氨酸、精氨酸和鳥氨酸等與植物抗逆性相關(guān)物質(zhì)的合成前體（Yang et al.，2017）。谷氨酸可分為L(zhǎng)-谷氨酸、D-谷氨酸和DL-谷氨酸，其中具有重要生物學(xué)意義的是L-谷氨酸（楊佳麗，2017）。Santos等（2002）報(bào)道，向日葵在鹽脅迫下會(huì)通過降低脯氨酸氧化酶（proline oxidase）活性和提高吡咯啉-5-羧酸還原酶（pyrroline-5-carboxylate reductase）與鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ornithine aminotransferase）活性來提高脯氨酸含量，并且通過提高谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase）活性來降低谷氨酸含量，他們認(rèn)為吡咯啉-5-羧酸還原酶和谷氨酰胺合成酶活性的提高是谷氨酸含量降低的主要原因。本試驗(yàn)中，白粉病菌處理的L-谷氨酸含量在接種后8 d和15 d兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)均比白粉病菌+BLG010處理和蒸餾水對(duì)照低，可能的原因是白粉病菌侵染苦瓜后，加大了用于抵御白粉病菌侵染的脯氨酸等抗逆性物質(zhì)的合成，從而導(dǎo)致L-谷氨酸過量消耗。咖啡酸是羥基苯丙烯酸類化合物，由4-香豆酸在肉桂酸-3-羥化酶（C3H）的催化下形成，屬于莽草酸途徑（包伊凡 等，2018）。咖啡酸在咖啡酸-O-甲基轉(zhuǎn)移酶（caffeic acid-O-methyltransferase）作用下生成阿魏酸，阿魏酸能抑制病原真菌的孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)，使植物發(fā)病速度得到抑制（賀軍花，2018）。咖啡酸和阿魏酸也是植物木質(zhì)素的合成前體，研究表明木質(zhì)素是植物防御病原菌的重要物質(zhì)（夏斐 等，2015；唐永萍 等，2017）。有研究報(bào)道，丹參和龍葵在非生物因子脅迫下會(huì)積累咖啡酸（鄧小鵬，2010；劉曉蕾，2011），這與本試驗(yàn)的結(jié)果相反，可能的原因是植物應(yīng)對(duì)生物脅迫與非生物脅迫的防御反應(yīng)機(jī)制不同。本試驗(yàn)中，苦瓜葉片受到白粉病菌侵染后咖啡酸含量下降的原因可能是，苦瓜受到白粉病菌侵染后加大了咖啡酸向阿魏酸生成的速度，生成大量的阿魏酸用于抑制白粉病菌的生長(zhǎng)，這與胡玉林等（2011）的研究結(jié)果類似，他們發(fā)現(xiàn)香蕉接種尖孢鐮刀菌后，阿魏酸的含量表現(xiàn)為上調(diào)；另一個(gè)原因可能是苦瓜受到白粉病菌侵染后加大了咖啡酸向木質(zhì)素轉(zhuǎn)化的速度，使苦瓜葉片細(xì)胞的細(xì)胞壁快速變厚，由此抑制白粉病菌菌絲在葉片內(nèi)擴(kuò)展，這與韓園園等（2012）和張海娥等（2014）的報(bào)道類似，他們發(fā)現(xiàn)蘋果和梨被病原菌侵染后，體內(nèi)木質(zhì)素的含量表現(xiàn)為上調(diào)；而無論是生成阿魏酸或者木質(zhì)素均能引起咖啡酸含量的降低。

本試驗(yàn)首次利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)發(fā)現(xiàn)了D-葡萄糖、肌醇半乳糖苷、L-谷氨酸、甘氨酸、甘油酸、延胡索酸和咖啡酸等7種物質(zhì)的含量變化與苦瓜白粉病病程相關(guān)，這為將來苦瓜白粉病抗病育種及防治提供了理論支撐。植物病害生物防治是生態(tài)友好型防治手段，能為農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供保障。芽孢桿菌是目前廣泛應(yīng)用的生防菌，已經(jīng)成功地用于防治黃瓜、番茄、南瓜等多種瓜果蔬菜病害。本試驗(yàn)采用的專利菌株—枯草芽孢桿菌BLG010對(duì)苦瓜白粉病的防治效果高達(dá)89.49%，為今后防治苦瓜白粉病生防菌株的選擇提供了可用資源。