抗番茄灰霉病菌的內(nèi)生短短芽孢桿菌W4菌株發(fā)酵條件優(yōu)化

楊從軍

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)植物醫(yī)學(xué)學(xué)院，山東省農(nóng)作物病蟲害綜合防控重點實驗室，山東青島 266109）

灰霉病是世界范圍內(nèi)普遍發(fā)生和廣泛分布的植物病害之一，嚴重危害蔬菜、水果等園藝植物生產(chǎn)，基于其科學(xué)和經(jīng)濟價值，灰霉病菌（Botrytis cinerea）被排在最重要的植物病原真菌第2位（Dean et al.，2012；Shin et al.，2017）。對灰霉病的防治常常依賴于化學(xué)殺菌劑的頻繁使用，但灰霉病菌是一種經(jīng)典的高風(fēng)險病原（Hahn，2014），已對多種殺菌劑產(chǎn)生抗性，如苯并咪唑類、苯氨基嘧啶類、二甲酰亞胺類、甾醇生物合成抑制劑等（Elad，1992；Baroffio et al.，2003；Zhao et al.，2010）。因此，篩選利用拮抗微生物或其活性代謝產(chǎn)物防治灰霉病成為研究熱點（Choi et al.，2009；Compant et al.，2013；Rana et al.，2016）。

菌株W4是從番茄莖中分離篩選到的1株內(nèi)生細菌，其發(fā)酵液稀釋10倍可完全抑制番茄灰霉病菌菌絲生長，根據(jù)形態(tài)、生理生化、16S rDNA序列和Biolog系統(tǒng)分析，W4菌株被鑒定為短短芽孢桿菌（Brevibacillus brevis）（Yang et al.，2011）。但模式種可利用葡萄糖和甘露糖發(fā)酵產(chǎn)酸，而W4菌株卻不能利用這兩種糖，因此被命名為Brevibucillus brevisW4（Yang et al.，2011）。 同時，Brevibucillus brevisW4菌株（以下簡稱W4菌株）發(fā)酵液還對金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、水稻白葉枯病菌（Xanthomonas oryzae）、大白菜軟腐病菌（Erwinia carotovora）、姜瘟病菌（Pseudomonas solanacarum）、 柑橘潰瘍病菌（Xanthomonas axonopodis）6種細菌均有抑制活性（楊從軍 等，2011）。為提高W4菌株發(fā)酵液活性，本試驗對W4菌株培養(yǎng)基成分及發(fā)酵條件進行優(yōu)化，以確定適合搖瓶培養(yǎng)的最佳方案，為抑菌活性的進一步研究開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2017年9～12月在青島農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)藥學(xué)實驗室進行。供試菌種短短芽孢桿菌W4菌株（Brevibucillus brevisW4），番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）均由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)藥學(xué)實驗室保存。

供試細菌培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（NA或NB）；病原真菌培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基。

碳源：果糖、丙三醇、腺苷、吐溫-40。氮源：蛋白胨、牛肉膏、酵母浸膏、大豆蛋白胨。無機鹽：氯化鈉、硫酸銨、碳酸鈣、硫酸鎂、磷酸二氫鈉。以上試劑均為分析純。

1.2 發(fā)酵液抑菌活性測定方法

采用菌絲生長速率法測定發(fā)酵液的抑菌活性。取W4菌株發(fā)酵液，在4 ℃、10 000 r·min-1下離心10 min，上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾。將3 mL發(fā)酵濾液與已滅菌并融化冷卻至50 ℃的PDA培養(yǎng)基42 mL混合均勻，即將發(fā)酵濾液稀釋15倍，平均傾入3個直徑為9 cm的培養(yǎng)皿內(nèi)，每個處理3次重復(fù)。挑取直徑6 mm的番茄灰霉病菌菌餅，使菌絲朝下，放于凝固的PDA平板中央。將接菌平板倒置于霉菌培養(yǎng)箱中，28 ℃恒溫培養(yǎng)。以加入3 mL無菌水的培養(yǎng)基為對照。一定時間后采用十字交叉法測量菌落直徑，以其平均值代表菌落大小，計算抑制率。

1.3 W4菌株發(fā)酵培養(yǎng)基配方優(yōu)化

碳源選擇：在NB培養(yǎng)基中分別加入不同濃度的果糖、丙三醇、腺苷、吐溫-40，其他成分保持不變，發(fā)酵后測定對灰霉病菌的抑制作用。

氮源選擇：分別以蛋白胨、酵母浸膏、牛肉膏、大豆蛋白胨不同含量代替NB培養(yǎng)基中的牛肉膏和蛋白胨，其他成分保持不變，發(fā)酵后測定抑菌活性。

無機鹽選擇：在NB培養(yǎng)基中分別添加不同濃度的 NaCl、（NH4）2SO4、CaCO3、MgSO4、NaH2PO4，其他成分保持不變，發(fā)酵后測定抑菌活性。

培養(yǎng)基配方正交設(shè)計優(yōu)化：根據(jù)單因素試驗將選擇出的果糖、蛋白胨和NaCl 3個因素，按L9（34）正交表優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基配方。按以上處理分別配制培養(yǎng)基，并調(diào)節(jié)pH值為7.4，裝液量為30 mL（100 mL三角瓶），接種量1%（體積分數(shù)，下同）。30 ℃，170 r·min-1振蕩培養(yǎng)24 h。

1.4 W4菌株發(fā)酵條件優(yōu)化

采用優(yōu)化培養(yǎng)基，對W4菌株發(fā)酵的初始pH值、接種種齡、接種量、裝液量、發(fā)酵溫度、搖床轉(zhuǎn)速、發(fā)酵時間進行優(yōu)化。每次將優(yōu)化后的結(jié)果應(yīng)用于下一因素的優(yōu)化中。初始pH值：3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0；接種種齡：12、16、20、24、28、32、36、40 h；接種量：1%、2%、5%、10%、15%、20%；裝液量（250 mL三角瓶）：30、40、60、80、100、120 mL；發(fā)酵溫度：28、30、32、35、37 ℃；搖床轉(zhuǎn)速：110、130、150、170、190 r·min-1；發(fā)酵時間：12、24、36、48、60、72、84 h。

1.5 優(yōu)化培養(yǎng)條件的抑菌活性對比

采用最佳培養(yǎng)基配方及最佳發(fā)酵條件對W4菌株進行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵濾液稀釋25倍后按1.2.1的方法測定其對番茄灰霉病菌的抑制活性，以原始發(fā)酵條件為對照，比較抑菌率大小。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用IBM SPSS Statistics軟件進行差異顯著性分析，采用Microsoft Excel軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 W4菌株發(fā)酵培養(yǎng)基配方優(yōu)化

2.1.1 碳源對W4菌株發(fā)酵液抑菌活性的影響 在發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入不同碳源，W4菌株發(fā)酵液對番茄灰霉病菌的抑菌活性差異明顯。以1.0%果糖作碳源，抑菌活性最好，抑制率為100.0%，顯著高于其他處理（圖1）。

圖1 碳源對W4菌株發(fā)酵液抑菌活性的影響

2.1.2 氮源對W4菌株發(fā)酵液抑菌活性的影響 在發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入不同含量的氮源，W4菌株發(fā)酵液對番茄灰霉病菌的抑菌活性由高到低依次為蛋白胨、大豆蛋白胨、酵母浸膏和牛肉膏。以1.5%的蛋白胨作為氮源時抑菌作用最強，抑制率達98.0%，顯著高于其他處理（圖2）。

圖2 氮源對W4菌株發(fā)酵液抑菌活性的影響

2.1.3 無機鹽對W4菌株發(fā)酵液抑菌活性的影響不同無機鹽對W4菌株發(fā)酵液抑菌活性存在較大影響。培養(yǎng)基中添加0.25%和0.50% NaCl的發(fā)酵液對番茄灰霉病菌的生長抑制率分別達95.6%、92.3%，較有利于抑菌活性物質(zhì)的產(chǎn)生，添加CaCO3和MgSO4的發(fā)酵液抑菌效果較差（圖3）。

2.1.4 發(fā)酵培養(yǎng)基正交設(shè)計優(yōu)化 采用正交設(shè)計試驗對培養(yǎng)基中果糖、蛋白胨和NaCl濃度進行優(yōu)化（表1），以發(fā)酵液的抑菌率為評價標準，本試驗的9個處理中，對番茄灰霉病菌生長抑制活性最好的培養(yǎng)基組合為A2B3C1，抑制率達98.2%；而正交優(yōu)化最佳處理為A2B3C2，即蛋白胨2.0%、果糖1.0%、NaCl 0.25%為培養(yǎng)基最優(yōu)配方組合。由極差R值的大小可以看出，3種成分對菌株發(fā)酵液抑菌活性影響的大小順序為蛋白胨＞果糖＞NaCl（表1）。

圖3 無機鹽對W4菌株發(fā)酵液抑菌活性的影響

表1 W4菌株發(fā)酵培養(yǎng)基正交試驗結(jié)果

2.2 W4菌株發(fā)酵條件優(yōu)化

2.2.1 初始pH值對W4菌株發(fā)酵液抑菌活性的影響 初始pH值為6.0～9.0時，W4菌株發(fā)酵液對番茄灰霉病菌的抑菌活性較強，當pH值＜6.0或＞9.0時，抑菌活性顯著降低（圖4）。初始pH值為3.0或4.0時，發(fā)酵24 h后，W4菌株幾乎沒有生長，發(fā)酵液清亮透明。最佳初始pH值為8.0，發(fā)酵液對番茄灰霉病菌生長抑制率達100.0%，顯著高于其他處理。

圖4 初始pH值對W4菌株發(fā)酵液抑菌活性的影響

2.2.2 接種種齡對W4菌株發(fā)酵液抑菌活性的影響接種種齡為20、24、28 h時，W4菌株發(fā)酵液對番茄灰霉病菌的抑菌活性無顯著差異，其中20 h時的抑制率最高，達100.0%（圖5）。接種種齡＜20 h或＞28 h，發(fā)酵液抑菌活性都顯著下降。綜合時間和成本，適宜的接種種齡為20 h。

2.2.3 接種量對W4菌株抑菌活性的影響 無論接種的種齡為20、24 h或28 h，接種量為5%時發(fā)酵液對番茄灰霉病菌的抑制率均達到100.0%，其余接種量發(fā)酵液的抑菌活性均明顯下降（圖6）。因此適宜的接種量為5%。

2.2.4 裝液量對W4菌株抑菌活性的影響 在裝液量為40～60 mL時，發(fā)酵液對番茄灰霉病菌的抑菌率為100.0%，減少或加大裝液量，抑制率均下降（圖7）。裝量較低可能無法滿足菌體生長所需營養(yǎng)，而裝量較大則導(dǎo)致溶氧減少，影響菌體生長。因此確定發(fā)酵液裝液量為50 mL，可保證W4菌株充分發(fā)酵，獲得更好的抑菌活性。

圖5 接種種齡對W4菌株發(fā)酵液抑菌活性的影響

圖6 接種量對W4菌株發(fā)酵液抑菌活性的影響

2.2.5 發(fā)酵溫度對W4菌株抑菌活性的影響 隨著發(fā)酵溫度由28 ℃逐漸升高，發(fā)酵液抑菌活性不斷增強，至35 ℃時抑菌活性最強，抑制率達98.0%。溫度繼續(xù)升高到37 ℃時，抑菌活性開始下降（圖8）。因此，確定發(fā)酵適宜溫度為35 ℃。

2.2.6 搖床轉(zhuǎn)速對W4菌株抑菌活性的影響 隨著搖床轉(zhuǎn)速提高，發(fā)酵液抑菌活性增強，轉(zhuǎn)速為150 r·min-1時的抑菌活性最強，抑制率達100.0%。轉(zhuǎn)速繼續(xù)增大，抑菌活性開始下降（圖9）。因此，確定液體發(fā)酵時搖床的理想轉(zhuǎn)速為150 r·min-1。

2.2.7 發(fā)酵時間對W4菌株抑菌活性的影響 在設(shè)定的發(fā)酵時間內(nèi)，發(fā)酵24 h的抑菌率達100.0%，短于或長于24 h，發(fā)酵液抑菌活性均降低（圖10）。因此理想的發(fā)酵時間為24 h。

圖7 裝液量對W4菌株發(fā)酵液抑菌活性的影響

圖9 搖床轉(zhuǎn)速對W4菌株發(fā)酵液抑菌活性的影響

2.3 優(yōu)化的發(fā)酵條件對抑菌活性的影響

在優(yōu)化的培養(yǎng)基和發(fā)酵條件下，發(fā)酵液稀釋25倍對番茄灰霉病菌菌絲生長的抑制率達92.8%，比未經(jīng)優(yōu)化得到的發(fā)酵液（65.9%）提高了26.9個百分點，表明優(yōu)化的培養(yǎng)基和發(fā)酵條件產(chǎn)生的發(fā)酵液對番茄灰霉病菌的抑制率明顯提高。

圖10 發(fā)酵時間對W4菌株發(fā)酵液抑菌活性的影響

3 結(jié)論與討論

本試驗確定了提高番茄內(nèi)生短短芽孢桿菌Brevibacillus brevisW4菌株發(fā)酵液抑制番茄灰霉病菌活性的最適培養(yǎng)基和發(fā)酵條件。優(yōu)化的培養(yǎng)基配方：蛋白胨2.0%、果糖1.0%、NaCl 0.25%；發(fā)酵條件：初始pH 8.0、接種種齡20 h、接種量5%、裝液量50 mL（250 mL三角瓶）、發(fā)酵溫度35 ℃、搖床轉(zhuǎn)速150 r·min-1、發(fā)酵時間24 h。在優(yōu)化的培養(yǎng)基和發(fā)酵條件下，發(fā)酵液稀釋25倍對番茄灰霉病菌菌絲生長的抑制率達92.8%，比未經(jīng)優(yōu)化得到的發(fā)酵液提高了26.9個百分點。

不同營養(yǎng)成分和發(fā)酵條件的改變會影響發(fā)酵液的抑菌活性。營養(yǎng)成分在微生物次級代謝的起動和代謝強度方面起著重要作用，限定營養(yǎng)成分具有發(fā)動特異代謝和調(diào)控的作用（Elibol，2004）。發(fā)酵過程中，發(fā)酵菌株需要從環(huán)境中吸收碳源、氮源、無機鹽、微量元素等一系列營養(yǎng)成分，通常培養(yǎng)基成分和抑菌化合物生物合成相關(guān)，其組成和配比對菌體生長發(fā)育、抑菌化合物產(chǎn)量和質(zhì)量、提取效率都有相當大的影響（曹軍衛(wèi) 等，2007）。為獲得高目標產(chǎn)物產(chǎn)量，在有效的發(fā)酵過程中設(shè)計一個合適的生產(chǎn)培養(yǎng)基是先決條件。另外，發(fā)酵過程復(fù)雜，特別是控制次級代謝產(chǎn)物的發(fā)酵非常困難，有時環(huán)境因素發(fā)生微小變化，目標產(chǎn)物就受到明顯影響（Chu & Constantinides，1988）。影響因子主要包括：種齡、接種量、溫度、pH值和溶氧量等，它們對發(fā)酵過程的影響各有不同，同時也會彼此影響。因此，本試驗從培養(yǎng)基和發(fā)酵條件兩方面對番茄內(nèi)生菌W4菌株的發(fā)酵條件進行了優(yōu)化，更有利于抑菌活性成分的產(chǎn)生、提取和分離。

內(nèi)生菌長期生活在植物體內(nèi)的特殊環(huán)境中并與宿主協(xié)同進化。一方面植物體為其提供生長必需的能量和營養(yǎng)；另一方面，內(nèi)生菌又可以通過自身的代謝產(chǎn)物或借助于信號傳導(dǎo)作用對植物體產(chǎn)生影響，特別在植物保護方面發(fā)揮作用（Ryan et al.，2008）。對135種分離到的代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)進行比較發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生菌產(chǎn)生新化合物的比例是51%，遠高于土壤微生物產(chǎn)生新化合物的比例，后者僅為38%（Schulz et al.，2002）。Leslie-Gunatilaka（2006）總結(jié)了400多種來源于128種植物內(nèi)生菌的天然產(chǎn)物，絕大部分有新的化學(xué)結(jié)構(gòu)和（或）有用的生物學(xué)活性。因此，充分研究內(nèi)生菌代謝產(chǎn)物，可能發(fā)現(xiàn)新的高活性化合物，開發(fā)更加有效、安全的殺菌劑（Corsini，2013）。