豇豆輕斑駁病毒海南分離物全基因組序列測定及分子特征

楊 曉 張 宇 陳 莎 劉 勇， 張德詠，* 李桑桑 龔一諾 張 卓 魯清華 胡 榮

（1湖南大學研究生院隆平分院，湖南長沙 410125；2湖南省農業科學院植物保護研究所，湖南長沙410125）

豇豆輕斑駁病毒（Cowpea mild mottle virus，CpMMV）屬乙型線形病毒科（Betaflexiviridae）香石竹潛病毒屬（Carlavirus），基因組為正單鏈 RNA，長度為8.3～8.7 kbp， 具 有 5′ 帽子和3′Poly（A）尾；編碼6個ORFs， 分別為RNA依賴的RNA聚合酶（RNA dependent RNA polymerase，RdRp）、三重基因塊 1（triple gene block1，TGB1）、三重基因塊 2（triple gene block 2，TGB2）、三重基因塊 3（triple gene block 3，TGB3）、外殼蛋白（coat protein，CP）和核酸結合蛋白（nucleic acid binding protein，NB）（Menzel et al.，2010）。

1973年首次發現CpMMV侵染非洲加納的豇豆（Brunt & Kenten，1973），隨后在亞洲、中東以及美洲均發現該病毒的侵染（Jeyanandarajah & Brunt，1993；Almeida et al.，2005；Zinsou et al.，2015）。CpMMV可由煙粉虱傳播，亦可種傳，其傳播速度快，主要侵染豆科（Leguminosae）、茄科（Solanaceae）、莧科（Amaranthaceae）和葫蘆科（Cucurbitaceae）等多種植物。主要發病癥狀為葉片輕斑駁，部分作物上還會產生葉片畸形和褪綠、甚至壞死等癥狀（Almeida et al.，2005）。

在前期病害調查中，發現CpMMV侵染海南的豆科植物，發病癥狀主要為葉片輕斑駁、部分植株矮化；發病株率為30%～85%，嚴重影響海南豆科植物的安全生產。因此，本試驗以從海南采集的感染CpMMV的豇豆病葉為材料，采用RT-PCR及常規測序，得到了CpMMV海南分離物的全基因組序列，并進行系統發育分析和重組分析，為該病毒的流行分析和致病性研究提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

疑似感染CpMMV的豇豆葉片，2016年1月采集于海南省澄邁縣，共采集病葉5份，感病葉片癥狀為輕斑駁。病葉進行液氮速凍后，保存于-80℃超低溫冰箱。

1.2 葉片總RNA抽提

試驗于2017～2018年在湖南省農業科學院植物保護研究所進行。葉片總RNA抽提采用Trizol法（Invitrogen）。在通風櫥中用研磨棒充分研磨約100 mg冷凍葉片，加入1 mL Trizol振蕩15 s，室溫靜置4 min；加入200 μL氯仿，漩渦振蕩30 s，室溫靜置 3 min；4 ℃下 12 000 r·min-1離心 15 min；移取500 μL上清液至新RNase-free離心管中，加入等體積異丙醇，輕輕顛倒混勻，-20 ℃靜置30 min；4 ℃下 12 000 r·min-1離心 10 min；棄掉上清液，用新配的75%乙醇洗滌沉淀，8 000 r·min-1離心3 min；重復洗滌1次；棄上清液，8 000 r·min-1離心30 s，小心吸出上清液；室溫晾干，取30 μL RNase-free H2O溶解，測定OD260/OD280值，檢測RNA的含量和純度，于-80 ℃保存備用。

1.3 引物設計與合成

引物設計根據Genbank中CpMMV基因組序列〔Genbank登錄號：KJ534277，KC884249（Glycine max），KC884245（Glycine max），NC014730（Vigna unguiculata），KC774020〕作為靶標序列，選擇CpMMV基因組序列相對保守區域，采用Primer Premier 5.0軟件設計5對引物（表1）擴增CpMMV全基因組序列，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 CpMMV全基因組擴增引物

1.4 RT-PCR擴增和序列測定

RT-PCR采用1st Strand cDNA Synthesis試劑盒（Takara）和 KOD DNA polymerase（Toyobo），具體參數參考說明書。PCR反應體系（50 μL）包括PCR Buffer 25 μL、上游 /下游引物（10 μmol·L-1）各 2.0 μL、dNTP Mix 1.0 μL、總 RNA 1.0 μL、酶混合液1.0 μL，補足ddH2O至50 μL。PCR反應程序：95 ℃預變性 3 min；95 ℃ 35 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 1.5 min，35個循環；最后72 ℃ 5 min。PCR產物采用MiniBEST Agarose Gel DNA純化試劑盒（Takara），純化PCR片段克隆到pEASY-T5載體，重組載體送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.5 序列拼接與分析

測定序列采用DNAstar 8.0軟件中的Seqman進行拼接，拼接后的序列同源性分析采用Genbank的 nblast進行在線分析（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）。序列系統發育樹采用 MEGA v5軟件構建（Tamura et al.，2011），序列重組分析采用RDP v3軟件（Martin et al.，2010）進行。

2 結果與分析

2.1 海南地區CpMMV田間癥狀

從圖1可以看出，疑似感染CpMMV的豇豆中下部葉片癥狀明顯，病葉癥狀為輕斑駁或斑駁黃化；上部葉片癥狀較輕，表現為輕微斑駁褪綠；部分植株稍矮化，少量病葉片表現為輕微畸形。

圖1 感染豇豆輕斑駁病毒的豇豆葉片（自然發病）

2.2 CpMMV基因組序列特征

RT-PCR檢測結果表明，采集的5份樣品均感染CpMMV，且PCR片段序列的核苷酸同源性高達100%，因此，隨機選擇其中一個樣本進行CpMMV全基因組測序。抽提總RNA，采用5對特異性引物進行RT-PCR擴增，以未添加模板作為陰性對照（CK）。從圖2可以看出，RT-PCR擴增得到了單一、與預期大小（800、1 253、2 297、2 205、3 052 bp）一致的目的條帶。將這些條帶純化后，連接T載體，采用通用引物進行測序。測序獲得序列利用 NCBI（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov）的VecScreen在線工具去除載體序列，采用DNAstar 8.0軟件中的Seqman進行拼接。拼接得到的CpMMV海南分離物基因組長度為8 193 bp，GenBank登錄號為KY420906。 CpMMV基因組3′UTR和 5′ UTR的長度分別為121 bp和72 bp。

圖2 RT-PCR擴增結果

2.3 系統發育分析

CpMMV的基因組同源性比對結果表明，CpMMV海南分離物基因組序列與美國佛羅里達分離物（KC774019）的同源性最高，為83.22%；與加納分離物（NC014730）的同源性最低，僅為63.00%。Genbank中共登錄有9條CpMMV基因組序列，全部下載后與CpMMV海南分離物進行序列聯配，進行系統發育分析（圖3）。所有CpMMV分離物大致可以分為3個亞簇，分別是巴西-美國亞簇、加納亞簇，以及CpMMV海南分離物亞簇。

圖3 CpMMV海南分離物基因組系統發育分析

2.4 重組分析

基于CpMMV基因組，采用RDP軟件分析重組事件（圖4），CpMMV海南分離物具有一個重組位點，其斷點為3 212～3 592 bp。重組片段的主要父本為加納分離物（NC014730）、次要父本為美國佛羅里達分離物（KC774020）。

圖4 CpMMV海南分離物重組分析

3 結論與討論

1973年首次發現CpMMV侵染豇豆（Brunt & Kenten，1973）， 但是我國直到2019年才有CpMMV發生的報道（劉勇 等，2019）。CpMMV能夠侵染豆科和茄科多種蔬菜作物，可種傳、也可由煙粉虱傳播，其傳播速度快，目前已廣泛分布于亞洲、美洲和非洲（Brito et al.，2012；Rosario et al.，2014）。CpMMV單獨侵染，其癥狀相對較輕，然而與其他植物病毒復合侵染，可導致嚴重的產量損失（Nsa & Kareem，2015）。因此，應加強該病毒的監測，預防該病毒在我國豆科和茄科等重要經濟作物發生流行。

本試驗結果表明，CpMMV海南分離物的基因組序列與美國分離物的同源性較高，但與非洲加納分離物的同源性較低，表明CpMMV在不同地域存在遺傳分化；基于CpMMV基因組序列的系統發育分析也進一步證實該結果。CpMMV巴西-美國分離物聚為一個亞簇，非洲加納和我國海南分離物各聚為一個亞簇，表明CpMMV的親緣關系可能與地理位置有直接聯系。因此，需測定更多CpMMV分離物的基因組序列，分析該病毒的遺傳分化特點，為該病毒的致病性研究提供科學依據。

重組在植物病毒的遺傳變異中發揮重要作用（Nagy，2011），CpMMV海南分離物的重組分析表明，在其基因組3 212～3 592 bp具有一個重組事件，其重組片段可能來源于美國和加納分離物之間的重組。表明CpMMV的親緣關系雖然與地理位置有關，然而來源于不同地域的分離物的重組，可促進該病毒適應新地理位置的寄主，從而促進該病毒的快速擴展。因此，需進一步開展該病毒的快速檢測技術、病毒遺傳變異等研究，為明確該病毒在我國的分布、流行性和致病性等研究提供技術手段和理論基礎。