添加腸道微生態制劑對于早產兒腸道菌群影響的研究

樊 娟 劉 華 田鸞英

深圳市南山區婦幼保健院兒科，廣東深圳 518067

每個新生兒都有其獨特的腸道微生物菌群圖譜，腸道菌群定植也是一個復雜的過程[1]。有研究表明，早產兒胃腸道菌群結構紊亂，多態性薄弱，能擾亂腸道正常功能，導致健康菌群定植明顯延遲，從而使早產兒致病菌定植增加、 免疫功能發育不健全以及感染增加，嚴重影響個體發育[2-3]。本研究通過Illumina HiSeq高通量測序平臺，分析選取的2015年7月～2016年7月于深圳市南山區婦幼保健院新生兒科住院早產兒病例，探討添加腸道微生態制劑對于早期早產兒腸道菌群的影響，進而證實盡早添加腸道微生態制劑有助于早產兒腸道有益菌的定植并促進其后期生長發育及健康。

表1 早產兒基本情況

1 對象與方法

1.1 對象

所有新生兒糞便標本均來源于深圳市南山區婦幼保健院新生兒病房，由1人收集。選取2015年7月～2016年7月在我院新生兒科住院早產兒，胎齡 32～34 周，出生體重在 1.5kg～2.5kg，母親產前1月未使用抗生素及微生態制劑，產時無感染，患兒出生時無缺氧窒息等搶救病史并且未使用抗生素，生后混合喂養病例。選取45例患兒，隨機分為g1、g2及g0組，因部分患兒失訪或治療過程因病情變化，從研究組中剔除，最終每組有6例患兒入組。每名患兒留取，生后 1d（t0）、7d（t1）、14d（t2）3個時間段大便標本。g1組生后即加用口服腸道微生態制劑雙歧桿菌（0.5次，3次/d），療程1周，g2組生后1周加用口服腸道微生態制劑雙歧桿菌（0.5次，3次/d），g0組不添加腸道微生態制劑。對所選取3組早產兒病例從胎齡、性別、體重進行分析，均無統計學差異（P＞0.05）。見表1。

1.2 方法

1.2.1 研究設計 本研究采集生后不同時間段添加益生菌的早產兒生后固定時間點標本，通過Illumina HiSeq高通量測序技術分析早期早產兒腸道內有益菌如雙歧桿菌、乳酸桿菌含量的變化。

1.2.2 總DNA提取及PCR擴增 采用 CTAB方法對樣本的基因組 DNA 進行提取，使用無菌水稀釋樣品至1ng/μL。以稀釋后的基因組 DNA 為模板，根據測序區域的選擇，使用帶 Barcode 的特異引物，New England Biolabs 公司的 Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer，和高效高保真酶進行PCR，確保擴增效率和準確性。引物對應區域：16S V4區引物（515F和806R）：此外，擴增區域還包 括：16S V3-V4/16S V4-V5；古 菌 16S V4；18S V9和ITS2區。

1.2.3 文庫構建和上機測序 使用TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進行文庫構建，文庫合格后，使用HiSeq2500 PE250進行上機測序[4]。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 早產兒腸道菌群結構

本研究共檢出4個菌門為主：變形菌門（Proteobacteria），硬壁菌門（Firmicutes），類桿菌門（Bacteroidetes），放線菌門（Actinobacteria），且 3 個時間段均以變形菌門及硬壁菌門為主。

2.2 2菌群與口服腸道徽生態制劑的交互作用

2菌群均與口服腸道微生態制劑時間有交互作用，乳酸桿菌（F=7.48，P=0.006），雙歧桿菌（F=6.91，P＜0.001），不同菌群不同時刻變化趨勢不一致。見圖1。

圖1 2菌群分布輪廓圖（A.乳酸桿菌；B雙歧桿菌）

2.3 乳酸桿菌分布單獨效應

乳酸桿菌分布固定組別單獨效應見圖1-A。g0、g1、g2組：菌落分布均呈逐漸上升趨勢。乳酸桿菌分布固定時刻單獨效應見表2。0時刻：3組標本在生后24h內均未檢測出乳酸桿菌，可能與出生時含量少有關，當然也不能排除DNA提取的問題；1周組：g0，g1，g2菌落分布三組間總的有統計學差異，P＜0.05；2周組：g0，g1，g2菌落分布三組間總的有統計學差異，g1/g2組較g0組含量明顯升高，P＜0.05，g1組較g2組差異無統計學意義（P＞0.05）。

表2 t0、t1、t2不同時刻乳酸桿菌組間重復測量分析（n=18）

表3 t0、t1、t2不同時刻雙歧桿菌組間重復測量分析（n=18）

2.4 雙歧桿菌分布單獨效應

雙歧桿菌分布固定組別的單獨效應見圖1-B。g0、g1、g2組：菌落分布均呈逐漸上升趨勢。雙歧桿菌分布分布固定時刻的單獨效應見表3。0時組：g0，g1，g2菌落分布三組間無統計學差異，P＞0.05；1周組：g0，g1，g2菌落分布三組間總的有統計學差異，P＜0.05；2周組：g0，g1，g2菌落分布三組間總的有統計學差異，g1/g2組較g0組含量明顯升高，P＜0.05，g1組較g2組差異明顯，P＜0.05。

3 討論

目前的研究已經證實胎兒的腸道是存在細菌的，新生兒出生后腸道菌群的定植與建立是一個復雜的、連續演變的一個動態過程[6-7]。腸道菌群的種類、數量受多種因素影響，如環境、胎齡、喂養方式、分娩方式、藥物應用等。早產兒腸道有益菌定植較遲，另外早產兒消化系統發育不成熟，胃腸動力、免疫防御等功能不完善，易患消化道疾病，因此盡早促進腸道有益菌定植，建立正常腸道菌群是尤為重要[8-10]。本研究采用高通量測序方法分析腸道菌群信息，與傳統的培養方法及 16S rDNA為基礎的分子生物學方法不同，高通量測序技術基于16S rDNA 的微生物群落分析中的要點，在于產生測序覆蓋深度極深的測序數據，并通過比對或聚類的分析方法，對數據來源的微生物物種進行分析，并估計微生物群落的物種構成，進而全面、準確地獲得菌群的信息[11]。本研究檢測了18例早產兒生后1、7、14d大便標本，均能檢測出細菌，但細菌種類及含量總體偏少，隨后日齡增長腸道菌群逐漸發生變化，出生初期在門水平含量最高的是：變形菌門（Proteobacteria），硬壁菌門（Firmicutes），其次是：類桿菌門（Bacteroidetes），放線菌門（Actinobacteria）。后變形菌門比例出現下降，但仍為優勢菌門，伴隨有硬壁菌門及放線菌門含量上升。出生時腸道菌群組成以腸桿菌、鏈球菌、腸球菌、類桿菌等需氧菌或兼性厭氧菌為主，隨后腸桿菌、腸球菌含量逐漸下降，而腸道有益菌如雙歧桿菌、乳酸桿菌明顯增加。

微生態制劑是比較安全的一類藥物，在日本、芬蘭、 意大利等發達國家，早產兒預防性使用益生菌制劑已作為常規治療手段超過10年，迄今為止，在全球范圍內沒有微生態制劑引起嚴重毒副反應的報道[12]。雙歧桿菌和乳酸桿菌是人體腸道正常菌群的主要菌種，也是目前微生態制劑應用最多的菌種，在發酵乳制品中的長期應用已經被證明了其安全性，極少有報道其潛在的致病性[13-15]。本研究中添加腸道微生態制劑周期雖短，但能促進腸道有益菌如雙歧桿菌、乳酸桿菌生長，且盡早添加微生態制劑更能促進雙歧桿菌定植。本研究亦有不足之處，添加腸道微生態制劑時間比較短，雖短期內達到預期效果，但遠期作用未能進一步研究，從新生兒出生至2～3歲腸道菌群種類及數量才逐步穩定，而在此期間，早期短時間添加腸道微生態制劑是否對后期建立正常腸道菌群有幫助，是否與長期服用微生態制劑療效一致，需進一步探討。