F血紅蛋白酸洗脫液溫度對Kleihauer-Betke實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確率的影響

朱宏遠(yuǎn)，樊 斐，曹 正，陳可心，曾甲子，謝 鑫，楊麗珺

近些年來，一種較為少見的產(chǎn)科疾病——胎母輸血綜合征(fetomaternal emorrhage,FMH)逐漸被人們所重視。FMH是指一定量的胎兒血液通過破損的胎盤絨毛間隙進(jìn)入母親體內(nèi)血液循環(huán)，所引起的胎兒不同程度的失血及母親和胎兒溶血性輸血反應(yīng)的臨床綜合征。因?yàn)槠浒l(fā)病隱匿，臨床表現(xiàn)無特異性，不易做出早期診斷，常引起胎兒嚴(yán)重貧血、水腫，圍生兒病死率高[1-4]。Kleihauer-Betke(K-B)實(shí)驗(yàn)是目前各醫(yī)院最常用的定量檢測母體血液循環(huán)中胎兒紅細(xì)胞數(shù)目的方法,可以確診并估計(jì)胎兒出血量，從而判斷胎兒失血的嚴(yán)重程度[5]。在臨床實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，酸性洗脫液的溫度是影響K-B實(shí)驗(yàn)結(jié)果的關(guān)鍵因素之一，本研究通過比較研究，旨在確定合適的酸性洗脫液溫度。

1 對象與方法

1.1 對象 選擇2018-01至2018-04在北京婦產(chǎn)醫(yī)院就診的孕婦作為研究對象，以K-B實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果≤0.1%的EDTA抗凝成人靜脈血為陰性對照組，EDTA抗凝臍帶血為陽性對照組。取同血型的臍帶血和未孕女性靜脈血定量混合作為檢測樣本，配制成臍帶血百分比含量為0.5%、1%、3%、5%、10%的5個(gè)水平的實(shí)驗(yàn)組檢測樣本。已發(fā)生明顯溶血的標(biāo)本和K-B實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果>0.1%的靜脈血標(biāo)本不宜用作檢測樣本的制作。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器 Olympus DP26光學(xué)顯微鏡；胎兒紅細(xì)胞計(jì)數(shù)軟件系統(tǒng)(北京穗加)。

1.2.2 試劑 80%乙醇(分析純)、95%乙醇(分析純)、蘇木精(分析純)、25%鹽酸(分析純)、氯化高鐵(分析純)、1%伊紅溶液均購自北京化工廠。pH(1.65±0.1)酸性洗脫液配置：由洗脫液A液與洗脫液B液按照5∶1混勻。洗脫液A液配置：蘇木精0.75 g溶于95%乙醇100 ml混勻；洗脫液B液配置：氯化高鐵2.4 g溶于25%鹽酸2 ml，混勻后，加入蒸餾水至100 ml。

1.3 方法

1.3.1 血涂片的制備 實(shí)驗(yàn)組和對照組的血液均以抗凝靜脈血(1.5～2.2 mg/ml EDTA-K2 抗凝)作為血液來源，按照常規(guī)方法推制血涂片。

1.3.2 K-B實(shí)驗(yàn)檢測血紅蛋白F (1)將血涂片自然干燥10 min，再用80%乙醇固定5 min，水洗待干；(2)配置酸性洗脫液；(3)將酸洗脫液均勻滴在固定好的血膜上，保溫洗脫1 min后，水洗待干；(4)用1%伊紅染液染1 min，水洗待干后鏡檢，在油鏡下，含有胎兒紅細(xì)胞的血紅蛋白(HaemoglobinF，HbF)的紅細(xì)胞被伊紅染液染成鮮紅色為陽性細(xì)胞，僅留下淡影的細(xì)胞膜者為陰性紅細(xì)胞；(5)利用北京穗加軟件有限公司開發(fā)的胎兒紅細(xì)胞計(jì)數(shù)軟件系統(tǒng)，進(jìn)行計(jì)數(shù)1000個(gè)以上紅細(xì)胞中胎兒陽性紅細(xì)胞所占百分率，作為胎兒紅細(xì)胞染色結(jié)果。根據(jù)《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》(第三版)，成人血紅蛋白F酸洗脫染色結(jié)果應(yīng)小于1%，故將HbF水平小于1%為陰性結(jié)果，HbF水平大于1%為陽性結(jié)果[6]。

1.3.3 不同洗脫液溫度的比較 分別制作臍帶血含量為0.5%、1%、3%、5%、10%的5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)水平的混合血液為檢測樣本，每一個(gè)水平的檢測樣本混合均勻后制作8張血涂片，均分用于兩個(gè)組。將1.3.2步驟(3)中洗脫環(huán)節(jié)溫度分別定于37 ℃和45 ℃，分別進(jìn)行K-B實(shí)驗(yàn)染色，最后分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定最適的洗脫溫度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組樣本分別進(jìn)行單組樣本均數(shù)的t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 穗加胎兒紅細(xì)胞計(jì)數(shù)軟件系統(tǒng)與常規(guī)光學(xué)顯微鏡下的效果比較 圖1所示，穗加胎兒紅細(xì)胞計(jì)數(shù)軟件識(shí)別每一個(gè)空泡樣陰性母血紅細(xì)胞，并標(biāo)注為藍(lán)色；識(shí)別紅色濃染的陽性胎兒紅細(xì)胞，標(biāo)注為紅色；計(jì)數(shù)1000個(gè)以上紅細(xì)胞中胎兒陽性紅細(xì)胞所占百分率。與光學(xué)顯微鏡相比,穗加胎兒紅細(xì)胞計(jì)數(shù)軟件不僅具有簡便快速的優(yōu)勢，還彌補(bǔ)了光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)準(zhǔn)確率低、結(jié)果偏差大等諸多缺點(diǎn)，故本研究使用該軟件進(jìn)行計(jì)數(shù)。

圖1 胎兒紅細(xì)胞計(jì)數(shù)兩種方法效果比較

2.2 洗脫溫度染色結(jié)果比較 如圖2A所示，洗脫溫度37 ℃時(shí)，成人紅細(xì)胞也被伊紅染成了淺粉色，沒有形成無色透明空泡樣，與含有HbF的胎兒紅細(xì)胞未形成鮮明對比；洗脫溫度為45 ℃時(shí)，成人紅細(xì)胞呈現(xiàn)無色透明空泡樣，與被伊紅染成淺粉色的含有HbF的胎兒紅細(xì)胞形成鮮明對比(圖2B)。

圖2 胎兒紅細(xì)胞不同洗脫溫度染色結(jié)果比較

2.3 不同溫度下K-B實(shí)驗(yàn)結(jié)果的比較 按照1.3.3進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表1所示，當(dāng)樣本為陰性標(biāo)本時(shí)(<1%)，洗脫溫度無論是37 ℃還是45 ℃，K-B法檢測結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)值之間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；當(dāng)標(biāo)本為陽性標(biāo)本時(shí)(≥1%)，洗脫溫度定為37 ℃的檢測結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)值之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而45 ℃的檢測結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)值之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 胎兒紅細(xì)胞不同洗脫溫度染色結(jié)果 (%)

3 討 論

目前，穗加胎兒紅細(xì)胞計(jì)數(shù)軟件是國內(nèi)唯一的一款全自動(dòng)胎兒紅細(xì)胞計(jì)數(shù)系統(tǒng)，依據(jù)圖像色差原理專為F血紅蛋白酸洗脫實(shí)驗(yàn)所創(chuàng)。實(shí)驗(yàn)室定量檢測母血中胎兒紅細(xì)胞是確診FMH的直接依據(jù)，而K-B法是目前應(yīng)用最廣泛的實(shí)驗(yàn)室定量檢測母血中胎兒紅細(xì)胞的方法[7，8]。K-B實(shí)驗(yàn)，又稱為酸洗脫實(shí)驗(yàn)，其原理為：胎兒紅細(xì)胞和成人紅細(xì)胞所含血紅蛋白種類不同，胎兒紅細(xì)胞的血紅蛋白為HbF，而成人紅細(xì)胞的血紅蛋白為HbA。HbF的抗酸能力強(qiáng)，置酸性洗脫液中一定時(shí)間只有含HbF的紅細(xì)胞不被洗脫，被伊紅染色為粉紅色。通過計(jì)數(shù)粉紅色細(xì)胞占全部紅細(xì)胞的比例以確定胎兒紅細(xì)胞的比例。但實(shí)際工作中K-B實(shí)驗(yàn)操作不規(guī)范，脫色時(shí)間短時(shí)，容易將不含HbF細(xì)胞錯(cuò)誤地計(jì)入胎兒紅細(xì)胞，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此，有一個(gè)實(shí)驗(yàn)效果優(yōu)良、結(jié)果準(zhǔn)確可信的K-B實(shí)驗(yàn)方法十分重要[9，10]。

在臨床實(shí)驗(yàn)工作中我們發(fā)現(xiàn)洗脫液的溫度對實(shí)驗(yàn)結(jié)果有一定的影響，基于此思路，本研究分別在洗脫液溫度37 ℃和45 ℃下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，本研究結(jié)果可以說明洗脫溫度定為45 ℃相比于37 ℃可產(chǎn)生更好的洗脫效果，胎兒紅細(xì)胞與成人紅細(xì)胞區(qū)分明顯，計(jì)數(shù)結(jié)果也更加準(zhǔn)確，可以有效解決洗脫效果不好、易給實(shí)驗(yàn)人員造成視覺干擾等問題。當(dāng)檢測樣本為陰性標(biāo)本時(shí)，洗脫溫度無論是37 ℃還是45 ℃，檢測結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)值之間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；當(dāng)檢測標(biāo)本為陽性標(biāo)本時(shí)，洗脫溫度定為37 ℃的檢測結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)值之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而45 ℃的檢測結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)值之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。綜上所述，將穗加胎兒紅細(xì)胞計(jì)數(shù)軟件與F-蛋白酸洗脫實(shí)驗(yàn)45 ℃水浴相結(jié)合，大大提高了實(shí)驗(yàn)的效率、陽性檢出率及準(zhǔn)確率等，為FMH的診治和預(yù)后判斷提供了良好的實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)支持。

目前K-B法應(yīng)用廣泛，具有使用儀器少、方便快捷、適合急診夜班使用的優(yōu)點(diǎn)[11]，而其缺點(diǎn)是對實(shí)驗(yàn)者操作要求較高、容易受到溫度等外在因素的干擾、大量的細(xì)胞計(jì)數(shù)易導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)者視覺疲勞、缺乏有效的質(zhì)量控制體系等，并且有研究發(fā)現(xiàn)，K-B法導(dǎo)致的假陽性率較高且重現(xiàn)性低[12]。