模擬正畸靜壓力刺激牙周膜干細(xì)胞增殖的TGFβ/STAT信號通路探討

劉 黎，趙新華，秦志勇

隨著人們生活水平的提高和對生活品質(zhì)的重視，牙齒正畸在臨床上得到越來越廣泛的應(yīng)用[1-2]。牙齒正畸是通過牙齒在機(jī)械力的作用下使之沿牙槽骨移動達(dá)到牙周組織的適應(yīng)性改建的目的[3]。牙周膜干細(xì)胞是牙周組織再生的關(guān)鍵細(xì)胞，具有廣泛增殖和分化成基質(zhì)細(xì)胞的潛能[4]。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的自主過程，但是目前尚未見到關(guān)于牙齒正畸過程中對牙周膜干細(xì)胞影響的報道[5]。TGFβ/STAT信號通路參與了細(xì)胞內(nèi)的多種生理及病理過程，且與牙周疾病的發(fā)病和治療密切相關(guān)[6]。本研究旨在分析模擬正畸靜壓力刺激牙周膜干細(xì)胞增殖的TGFβ/STAT信號通路參與機(jī)制，為相關(guān)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及試劑 牙周膜干細(xì)胞采用全牙消化法原代培養(yǎng)(材料來自我院頜面外科正畸拔除的前磨牙)，經(jīng)低密度接種法篩選培養(yǎng)至第4代并經(jīng)成骨誘導(dǎo)和成脂誘導(dǎo)后檢測相關(guān)蛋白確認(rèn)后作為研究材料(培養(yǎng)條件37 ℃、5%二氧化碳)。細(xì)胞總蛋白提取試劑盒購自碧云天公司；α-MEM培養(yǎng)液購自Gibco公司；胎牛血清購自杭州四季青公司；PPARγ及l(fā)pl第一抗體購自R&D公司；ALP及sp7第一抗體購自美國Abcam公司；二抗及顯色試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；Bax及Bcl2一抗購自Santa Cruz公司；酶標(biāo)儀購自累杜公司；超凈工作臺購自賽默飛世爾公司；倒置顯微鏡購自日本奧林巴斯公司；二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱購自賽默飛世爾公司；高速冷凍離心機(jī)購自Eppendorf公司；垂直電泳儀及轉(zhuǎn)膜儀購自伯樂公司。

1.2 分組及處理方法 成骨誘導(dǎo)和成脂誘導(dǎo)后確認(rèn)的牙周膜干細(xì)胞培養(yǎng)至狀態(tài)良好后進(jìn)行處理：加壓至100 kPa分別處理1、6、12 h，檢測細(xì)胞的增殖及相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。注意確認(rèn)加壓過程中加壓艙的密閉性和恒定性。將同類型牙周膜干細(xì)胞置于相同的加壓艙內(nèi)但不進(jìn)行加壓作為對照組。

1.3 Western blotting法 將加壓處理組和對照組細(xì)胞提取總蛋白并定量后，以相同量總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE垂直電泳。電泳結(jié)束后進(jìn)行半干法轉(zhuǎn)膜(30 min，330 mA)。轉(zhuǎn)膜后將硝酸纖維素膜進(jìn)行BSA的封閉。然后將封閉后的纖維素膜與待檢測分子的一抗(1∶200)進(jìn)行孵育90 min，沖洗3次后將沖洗后的纖維素膜與二抗(1∶600)進(jìn)行雜交90 min。PBS沖洗后進(jìn)行顯色，拍照。

2 結(jié) 果

2.1 多向分化能力鑒定牙周膜干細(xì)胞 牙周膜干細(xì)胞經(jīng)成脂誘導(dǎo)后PPARγ蛋白和lpl蛋白的表達(dá)水平明顯升高(P<0.05，表1)，牙周膜干細(xì)胞經(jīng)成骨誘導(dǎo)后ALP蛋白和sp7蛋白的表達(dá)也明顯升高(P<0.05，圖1)。

圖1 多向分化能力鑒定牙周膜干細(xì)胞

2.2 加壓處理對牙周膜干細(xì)胞細(xì)胞增殖影響 與對照組相比，牙周膜干細(xì)胞經(jīng)加壓處理1 h和6 h后增殖被顯著抑制(P<0.05)，且Bax的表達(dá)明顯升高(P<0.05)而Bcl2的表達(dá)明顯降低(P<0.05)，而處理12 h細(xì)胞的增殖情況及上述蛋白表達(dá)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，圖2、3，表2)。

圖2 加壓處理對牙周膜干細(xì)胞細(xì)胞增殖影響

圖3 加壓處理對牙周膜干細(xì)胞細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)的影響

1.對照組處理1 h；2.加壓處理1 h；3.對照組處理6 h；4.加壓處理6 h；5.對照組處理12 h；6.加壓處理12 h

2.3 加壓處理對牙周膜干細(xì)胞TGFβ及STAT蛋白表達(dá)的影響 與對照組相比，牙周膜干細(xì)胞經(jīng)加壓處理1h和6h后TGFβ及STAT2的表達(dá)明顯升高(P<0.05)，而處理12 h的細(xì)胞增殖情況及上述蛋白表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05，圖4，表3)。

組別對照組加壓處理組tPBcl2/β-actin 處理1 h0.40±0.050.33±0.052.645<0.05 處理6 h0.41±0.070.29±0.053.358<0.05 處理12 h0.40±0.040.39±0.070.425>0.05Bax/β-actin 處理1 h0.26±0.040.34±0.052.584<0.05 處理6 h0.27±0.060.42±0.083.154<0.05 處理12 h0.26±0.050.27±0.040.542>0.05

圖4 加壓處理對牙周膜干細(xì)胞細(xì)胞TGFβ及STAT蛋白表達(dá)的影響

1.對照組處理1 h；2.加壓處理1 h；3.對照組處理6 h；4.加壓處理6 h；5.對照組處理12 h；6.加壓處理12 h

組別對照組加壓處理組tPTGFβ/β-actin 處理1 h0.30±0.050.34±0.062.365<0.05 處理6 h0.31±0.080.39±0.072.854<0.05 處理12 h0.30±0.060.30±0.080.441>0.05STAT2/β-actin 處理1 h0.28±0.080.32±0.063.147<0.05 處理6 h0.28±0.070.43±0.082.548<0.05 處理12 h0.28±0.050.29±0.070.228>0.05

3 討 論

以往的研究也證實正畸過程涉及多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的參與，其中集中在MAPK信號通路，Wnt/β-catenin信號通路，PI3K/AKt/m TOR信號通路，BMP-2信號通路，Caspase-3介導(dǎo)的凋亡通路較多[7]。在分析玻璃離子水門汀對青少年正畸后局部組織炎性反應(yīng)、細(xì)胞凋亡及膠原代謝影響的研究中也發(fā)現(xiàn)玻璃離子水門汀用于青少年正畸能夠較牙釉質(zhì)黏合劑更為有效地抑制炎性反應(yīng)、細(xì)胞凋亡，并改善膠原代謝[8]。在分析增齡性因素對正畸牙齒移動過程中牙周組織細(xì)胞凋亡時也證實細(xì)胞凋亡可能參與了正畸牙齒移動，但是增齡性因素使得成年組牙周組織細(xì)胞凋亡增加，進(jìn)而影響各類細(xì)胞比例,改變牙周組織改建的速度和效果，使得牙齒移動速度減慢[9]。本研究也發(fā)現(xiàn)加壓處理1 h和6 h后細(xì)胞Bax明顯增強(qiáng)而Bcl2水平明顯減弱，表明模擬正畸靜壓力刺激可明顯抑制體外培養(yǎng)的牙周膜干細(xì)胞的增殖過程。

TGFβ/STAT信號通路相關(guān)蛋白可能參與了牙齒的正畸過程。在分析骨膜蛋白在正畸牙周膜改建中的表達(dá)及調(diào)控機(jī)制時發(fā)現(xiàn)TGFβ-B1-PN-FAK可能通過激活下游的Akt磷酸化信號通路,對正畸力牙周膜改建中進(jìn)行調(diào)控[10]。在分析正畸驅(qū)動的骨皮質(zhì)切開術(shù)對巨噬細(xì)胞的作用及機(jī)制進(jìn)行研究時也證實正畸驅(qū)動的骨皮質(zhì)切開術(shù)通過活化并促進(jìn)巨噬細(xì)胞的分型進(jìn)而影響牙槽骨密度并促進(jìn)牙齒的移動，其中NF-κB及JAKSTAT信號通路的激活可能發(fā)揮重要作用[11]。以往的研究也發(fā)現(xiàn)正畸力作用下大鼠前扣帶皮質(zhì)層中STAT1表達(dá)水平一過性降低,p-STAT1表達(dá)水平一過性升高，推測正畸疼痛的產(chǎn)生可能與前扣帶皮質(zhì)層STAT1活化為p-STAT1有關(guān)[12]，且25 g/cm2靜壓力作用下HGFs中的TGF-β1的表達(dá)有關(guān)[13]。在分析信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子3在正畸力介導(dǎo)的骨改建中的表達(dá)時也發(fā)現(xiàn)正畸力可增強(qiáng)牙槽骨改建，張力區(qū)STAT3的表達(dá)改變可能與正畸牙移動的骨改建相關(guān)[14]。但上述研究均未對牙周膜干細(xì)胞的凋亡情況及相關(guān)分子機(jī)制進(jìn)行研究。本研究發(fā)現(xiàn)加壓處理1h和6h后細(xì)胞Bax明顯增強(qiáng)而Bcl2水平明顯減弱，TGFβ/STAT信號通路蛋白TGFβ及STAT2表達(dá)明顯增強(qiáng)，而處理12時干細(xì)胞的上述蛋白表達(dá)無明顯差異，表明模擬正畸靜壓力刺激可明顯抑制體外培養(yǎng)的牙周膜干細(xì)胞的增殖過程，其可能與TGFβ/STAT信號通路異常有關(guān)。

因此，模擬正畸靜壓力刺激可明顯抑制體外培養(yǎng)的牙周膜干細(xì)胞的增殖過程，其可能與TGFβ/STAT信號通路異常有關(guān)。