通過滲透微泵穩定抑制小鼠血漿CD26/DPPIV分子酶活性的研究

薛興奎 韓新華 蔡思齊 陳曉玲 Melody Y. Zeng

(1.深圳市龍華區人民醫院中心實驗室，廣東深圳 518109；2.深圳市南山區蛇口人民醫院內分泌科，廣東深圳 518109；3.南方醫科大學研究生院檢驗技術系，廣州 501505)

CD26/DPPIV是多功能蛋白分子，在T細胞、上皮細胞等組織細胞上均有表達，在體內有兩種存在形式：細胞表面分子和可溶性分子。可溶性分子廣泛存在于血清/血漿、關節液等體液中[1]。CD26/DPPIV具有絲氨酸蛋白酶活性，能夠特異性切割N-末端的脯氨酸或丙氨酸，不但對于增強細胞對刺激信號的反應起著重要作用，而且在關節炎等疾病中也發揮重要的調控作用。CD26分子作為T細胞的協同刺激因子，參與多種免疫學效應。西他列汀(Sitagliptin)是一種高效CD26/DPPIV抑制劑，能夠特異性抑制DPPIV蛋白酶活性。利用西他列汀長久而穩定的抑制DPPIV酶活性，對于研究CD26/DPPIV分子功能，探索其在多種疾病中的發病機制，具有重要的意義。研究[2]顯示，小鼠和人體體內DPPIV活性難以得到穩定而持續的抑制，常規給藥方法導致CD26/DPPIV酶活性呈波動狀態，影響實驗的穩定性與重復性。微滲透泵是一種較為理想的持續給藥系統，本課題組擬采用滲透泵體內植入給藥，研究小鼠體內西他列汀給藥效果，探索穩定持久的DPPIV酶活性抑制方式。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要材料

SPF級 BL6/C57 雄性小鼠，8～12周齡，體質量18～22g，由中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院實驗動物中心提供，實驗動物許可證號：SYXK(粵)2015-0063。西他列汀購于美國Selleck Chemical公司。微滲透泵(Model:2001)由美國Alzet公司生產。將實驗小鼠分為西他列汀皮下注射200、100、50 mg/kg組和滲透泵植入(內含200 mg/kg西他列汀)組，滲透泵植入[內含0.9%(質量分數)氯化鈉注射液]組，每組小鼠數量為6只，實驗至少重復2次，各組小鼠分別于給藥后1、2、4、8、16、24 h采血。

1.2 滲透泵植入

按照微量滲透泵說明書和參考文獻[3]進行手術植入滲透泵，在無菌工作臺內腹腔麻醉小鼠后，在小鼠后頸部作一個長約1．5 cm橫切口，植入灌注西他列汀(200 mg/kg劑量西他列汀)或0.9%(質量分數)氯化鈉注射液(對照組)的Alzet微滲透泵并無菌縫合，滲透泵保留皮下24 h。

1.3 血漿藥物濃度與DPPIV蛋白酶活性監測

按照給藥后不同時間點，從小鼠尾靜脈取血，室溫離心后取血漿。西他列汀血藥濃度采用高效液相串聯質譜儀(美國Thermo Fisher公司)檢測，氟西汀作為內標參照。DPPIV 蛋白酶活性監測采用美國ENZO Life Science公司試劑盒方法，用二甲基亞砜(DMSO)及DPPIV 緩沖液溶解底物GlyPro-pNA，取緩沖液、血清樣本及底物置于96孔平底培養板中，在37 ℃中反應30 min，在多功能酶標儀(美國Biotek公司)上分別讀出A405值。取500 mmol/L的純pNA倍比稀釋后讀出相應的A405值作標準曲線，計算DPPIV蛋白酶活性相對于對照組的標準值。

1.4 流式細胞術檢測小鼠脾T細胞CD26分子

將給藥后24 h的小鼠處死后，采用無菌操作法取脾臟，并制成細胞懸液，采用抗體磁珠法純化T細胞(德國Miltenyi公司)。用FACS緩沖液洗滌，洗滌后分成每管細胞為1×106個，分別加入同型對照、PE-CD26(美國BD公司)各10 μL抗體，室溫避光15 min，緩沖液洗滌2次，采用流式細胞儀(美國BD公司)上機分析，數據應用Flow Jo軟件分析。

1.5 小鼠T細胞遷移實驗

T細胞遷移實驗采用Transwell培養系統的24孔板檢測，經注射不同濃度西他列汀的小鼠脾T細胞置于膜上的小室，膜下的小室加入含有基質細胞來源因子1α(storma cell derived factor 1α,SDF-1α)的無血清培養基AIM-V，在37 ℃孵箱孵育4 h后，計數穿越薄膜的細胞。結果采用相對于對照組細胞數目的百分比表示。

1.6 病理切片觀察小鼠皮膚

將處死小鼠皮膚組織滲透泵周邊皮膚約0.5 cm取下，固定于10%(體積分數)甲醛內，縱向和橫向切取，按常規制備石蠟切片，切片厚度為5 μm，蘇木精-伊紅(HE)染色，用 Olympus顯微鏡觀察并照相。

1.7 統計學方法

2 結果

2.1 西他列汀血藥濃度

為研究不同給藥方法對血藥濃度的影響，分別給予小鼠西他列汀不同劑量直接皮下注射或皮下微泵組植入小鼠皮下，微泵組西他列汀血藥濃度變化趨勢與皮下注射組相比，差異有統計學意義(P<0.05)，藥物劑量比皮下注射穩定。直接皮下注射西他列汀在6～8 h血藥濃度明顯下降，在給藥后24 h無法檢測到，而通過滲透泵給藥組血藥濃度可維持至24 h(圖1)。

2.2 西他列汀抑制小鼠體內DPPIV蛋白酶活性

通過DPPIV活性檢測，發現給藥8 h后，在皮下注射用藥組中，小鼠血清中的DPPIV酶活性與基線比較，差異無統計學意義(P>0.05)。經皮下滲透泵給藥組(200 mg/kg)中，小鼠血漿中DPPIV酶活性明顯降低且能持續24 h，與0.9%(質量分數)氯化鈉注射液對照組相比，差異有統計學意義(P<0.05)，詳見圖2。

圖1 血藥濃度-時間曲線Fig.1 Plasm concentration-time curve in the mice

圖2 西他列汀抑制血漿CD26/DPPIV活性Fig.2 CD26/DPPIV enzyme inhibited by Sitagliptin

2.3 西他列汀對小鼠脾T細胞CD26/DPPIV分子表達和T細胞遷移的影響

收集注射西他列汀24 h后的小鼠脾T細胞，采用流式細胞檢測CD26/DPPIV分子的表達，與對照組相比，CD26分子的表達無明顯變化，西他列汀不影響細胞表面CD26/DPPIV分子的表達(圖3A)。為了研究CD26分子在T細胞遷移中的作用，收集注射西他列汀24 h后的小鼠脾細胞，采用抗體磁珠法純化后，檢測T細胞的趨化遷移能力。經滲透泵給藥處理的T細胞遷移數量與對照組相比，減少了36.01%(P<0.05，圖3B)。

2.4 小鼠耐受性良好

滲透泵經手術植入到小鼠皮下，長約1.5 cm，對小鼠是一種額外的負擔。在本實驗中，植入滲透泵小鼠的活動度與飲食無明顯異常。在小鼠骨髓移植等器官移植模型中，皮膚損害是常見的移植物抗宿主病表現，如果微泵對皮膚造成損傷將影響實驗結果。為觀察西他列汀通過滲透泵給藥能否引起皮膚損傷，處死植入滲透泵24 h的小鼠后取泵旁皮膚制作病理切片，行HE染色，觀察小鼠皮膚病理變化。西他列汀藥物組小鼠與0.9%(質量分數)氯化鈉注射液小鼠相比，大致正常，無明顯炎性反應(圖4)。

3 討論

CD26/DPPIV分子是參與T細胞信號傳導過程中的一種具有絲氨酸蛋白酶活性的糖蛋白分子，在T細胞活化后表達增高，同時參與多種疾病的發病機制。CD26相對分子質量為110 000，能夠特異性切割N-末端的脯氨酸或丙氨酸[4]，廣泛存在于血清/血漿、腦脊液、關節液中；跨膜蛋白分子在眾多組織中都有表達，如骨髓、血管內皮細胞、肺、脾、胰、肝、腸道和多種上皮細胞[5]。數種關鍵細胞因子和趨化因子都是CD26分子蛋白酶的底物，包括RANTES、CCL11、巨噬細胞來源的趨化因子(CCL22)、CXCL10等[6]。西他列汀是CD26分子的特異性抑制劑，能夠抑制CD26分子的蛋白酶活性。鑒于DPPIV在血漿等各種體液中存在，起著多種不同的作用，因此成為免疫、器官移植、內分泌等多學科研究人員的研究靶點[7]。特異性抑制劑西他列汀成為研究CD26/DPPIV分子功能與體內作用的重要工具。在前期體外研究中發現，西他列汀能夠在較低劑量情況下抑制血漿中DPPIV酶活性。而在小鼠體內，DPPIV分子酶活性由于受復雜的體內環境影響，很難得到穩定而完全的抑制。Farag等[8]在藥代動力學臨床試驗中發現，人體西他列汀血藥濃度與血漿中DPPIV濃度相關，DPPIV酶活性在2 h左右達到最大抑制，隨后6～10 h內恢復至接近正常。Waget等[9]報道，每只400 μg西他列汀不能明顯的抑制小鼠體內血漿DPPIV活性。這些研究[8-10]結果提示，穩定而持久的血漿濃度是西他列汀有效抑制DPPIV酶活性的前提條件。

圖3 小鼠脾T細胞CD26表達與遷移Fig.3 CD26 expression and migration on spleen T cells

A:CD26 expression;B:migrated T cells.*P<0.05vssaline control group; The spleen T cells were harvested 24 hours post treatment and were assayed for migration.

圖4 小鼠皮膚的病理形態學檢測Fig.4 Pathological morphology of mice skin

為了獲得理想穩定的血藥濃度，本研究選用了ALZET皮下滲透泵，結果顯示與一次性皮下注射相比，接受滲透泵藥物治療組血藥濃度相對穩定，在給藥后24 h仍有較高的血藥濃度，而無滲透泵組在給藥后24 h無法檢測到西他列汀。同時，滲透泵組小鼠血漿CD26/DPPIV酶活性被穩定持久的抑制，而一次注射組DPPIV活性在給藥后第2小時降低，但在給藥后第8小時檢測發現接近正常值。這些結果說明，DPPIV活性可以通過滲透泵給藥得到穩定而持久的抑制，同時避免了每天多次注射的繁瑣。但是并非所有的小分子化合物都適合使用滲透泵，結果會根據藥物的體內分布模式、代謝途徑的不同而具有明顯差異[10]。

CD26分子及其具有的蛋白酶活性是調節T細胞活化與執行免疫功能的重要分子，對于增強細胞刺激信號的反應起著重要作用，在關節炎、心力衰竭、Crohns腸病等疾病中起著重要的調控作用。DPPIV分子酶活性與小鼠免疫功能密切相關，通過多種途徑參與免疫細胞激活、活化、增生等。采用滲透泵給予西他列汀藥物小鼠組的脾T細胞遷移能力受到明顯的抑制，而一次性給藥組無明顯變化，提示通過滲透泵給藥是體內研究DPPIV對免疫功能影響可以更好地模擬穩態環境。與不同濃度的一次性給藥組相比，滲透泵給藥組的小鼠脾T細胞CD26分子表達無明顯變化。這些提示西他列汀是通過抑制DPPIV蛋白酶活性而不是影響T細胞CD26分子表達而影響T細胞遷移。

滲透泵需要皮下植入，對于小鼠是一種額外的負荷，通過對小鼠活動度、飲食的監測與觀察，滲透泵給予西他列汀沒有明顯降低小鼠的活躍度。在骨髓、肝腎等器官移植小鼠模型中，滲透泵需要長期植入[11-12]。由于滲透泵是皮下植入，本研究提取了植入滲透泵附近的小鼠皮膚進行病理切片檢查，發現皮膚無明顯異常，提示通過滲透泵給予西他列汀對皮膚無明顯刺激和損害，可以用于小鼠移植物抗宿主病等研究模型。

在本實驗研究中，為了獲得穩定的DPPIV酶活性抑制，研究了皮下滲透泵作為西他列汀的給藥方式，發現通過滲透泵給藥可以提高血藥濃度，持續抑制小鼠體內DPPIV活性，并且有效的長時間抑制T細胞遷移，對小鼠體質量和皮膚無明顯影響。這些結果顯示，采用滲透泵給予西他列汀，可在動物體內更好的控制酶活性，對于研究CD26分子的功能與相關效果體內研究提供了有效的給藥途徑。