銀杏葉提取物對帕金森病模型大鼠腦內神經炎性反應的影響

張 輝 馬惠清 王森茂 王曉娟

(首都醫科大學附屬北京朝陽醫院綜合內科，北京 100020)

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)又稱為震顫麻痹，是一種多發于老年人群的神經系統退行性疾病。其主要的病理特征為腦內多巴胺能神經元變性壞死，由此引起黑質紋狀體通路遭受破壞，殼核、尾狀核中多巴胺的含量降低，從而誘發一系列錐體外系癥狀[1]。PD的發生是年齡因素、環境因素以及遺傳等相互作用的結果，但其具體病因和發病機制仍不明確[2]。神經炎性反應是由小膠質細胞和星形膠質細胞產生多種神經炎性反應因子導致的細胞和組織損傷[3]，最終導致神經元凋亡和壞死，加劇神經變性過程。近年來，研究[4]證實，慢性神經炎性反應損傷在PD的發病中起著至關重要的作用。

核因子-κB(nuclear factor-κB， NF-κB)是一類能與多種基因啟動子部位的κB位點發生特異性結合并促進轉錄的DNA結合蛋白的總稱。它能夠與許多基因啟動子區域的固定核苷酸序列結合而啟動基因轉錄，從而在機體的免疫應答、炎性反應以及細胞的生長調控等方面發揮重要作用[5]。在神經系統中，NF-κB幾乎存在于所有類型細胞中，主要包括神經元、星形膠質細胞、小膠質細胞和少突膠質細胞，是能夠調節多種炎性反應和免疫基因表達的一種重要的轉錄調節因子，參與調節許多促炎物質，如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白細胞介素-1β(interleukin-1β， IL-1β)等的轉錄[6]。

銀杏葉提取物(ginkgo biloba extract，EGb)是從銀杏葉中分離純化的提取物，近年來，藥理學研究[7]證實，銀杏葉提取物具有抗血小板活化因子、抗心腦缺血、降血脂、抗氧化、抗炎性反應和增強記憶等功能。

本研究利用魚藤酮皮下注射制備PD大鼠模型，同時給予不同劑量的銀杏葉提取物觀察其對腦內星形膠質細胞和小膠質細胞表達的影響，同時觀察其黑質多巴胺能神經元中NF-κB的調控及其對腦內神經炎性反因子TNF-α和IL-1β表達的影響。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

全自動酶標儀(Beckman公司，美國)，UV260紫外分光光度儀(Shimadzu公司，日本)，BiometraUnio II PCR儀(Biometra公司，德國)，Olympus AX70/Coolsnapfx/MetaMorph顯微圖像分析系統(Olympus公司，日本)，低溫離心機(Beckman公司，美國)，Western blotting成像系統(Vilber Fusion Solo公司,法國)。

魚藤酮(Sigma公司,美國)，銀杏葉提取物滴劑(威瑪舒培博士藥廠,德國)，TNF-α和IL-1β檢測試劑盒(南京建成生物科技有限公司)，酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase, TH，Sigma公司,美國)、NF-κB P56抗體(Abcam公司,美國)，β-actin和山羊抗兔IgG抗體(1∶1 000，Santa Cruz公司,美國)。

3月齡雄性SD大鼠32只，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，實驗動物許可證號：SCXK(京)2012-0001。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組

將32只實驗大鼠采用數字表法隨機分為對照組、PD模型組、低劑量組和高劑量組，每組8只。所有實驗大鼠在實驗期間自由進食水，在同一實驗室按照清潔級標準飼養。

1.2.2 動物模型的制備及藥物干預

PD模型組和藥物干預組(低劑量和高劑量)大鼠按照2.0 mg·kg-1·d-1背部皮下注射魚藤酮(魚藤酮溶解在葵花籽油中混勻， 4 ℃避光保存)，其中治療組大鼠在魚藤酮注射前30 min給予EGb灌胃治療共30d，給藥濃度為高劑量組100 mg·kg-1·d-1和低劑量組50 mg·kg-1·d-1，對照組大鼠給予背部皮下注射葵花油1 mL/kg。

1.2.3 取材

藥物干預24 h后，直接將大鼠斷頭取腦，在冰板上用刀片迅速分離中腦、紋狀體和大腦皮質，放入液氮速凍后轉入低溫冰箱備用。

1.2.4 蛋白提取及濃度測量

取每只大鼠中腦和同側紋狀體組織，加入RIPA組織裂解液，勻漿器放在冰浴中，以2 000 r/min上下勻漿20次，然后吸至1.5 mL離心管中。冰浴放置30 min。4 ℃, 10 000 r/min，離心30 min。小心吸出上清，按實驗需要分裝放入EP管中，-80 ℃儲存備用。按蛋白定量試劑盒微量測定方法測定組織勻漿總蛋白含量。分別取25 μL蛋白標準液和樣品勻漿液 (1∶40)，放入96孔板中，加200 μL工作液(A∶B=50∶1)，30 s混勻。置培養箱中37 ℃孵育30 min。冷卻到室溫，用酶標儀在570nm測定各孔吸光度值，根據標準曲線計算樣品蛋白含量。

1.2.5 酶聯免疫吸附法

采用酶聯免疫試劑盒檢測TNF-α和IL-1β，取適量紋狀體組織標本，研磨勻漿，取適量加至已包被抗體的酶標板孔內，4 ℃緩慢搖晃孵育過夜，采用試劑盒自帶的洗滌液進行洗滌，加入一抗，室溫孵育2h，洗滌，再加入二抗，洗滌后進行TMB顯色，用酶標儀在450nm測定各孔吸光度值。

1.2.6 Western blotting

取適量相關樣本蛋白，經聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電轉移至NC膜上，用5%(質量分數)脫脂奶粉室溫封閉，依照實驗目的分別加入兔源GFAP(1∶1 000)、Iba1和NF-κB P65抗體(1∶500)，4 ℃過夜。NC膜以TTBS洗3次。山羊抗兔IgG 抗體(1∶1 000)室溫避光1 h，漂洗3次，成像系統掃描并測定目標蛋白吸光度值，與β-actin ( 1∶3 000) 比值后，做統計學分析。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 實驗大鼠的一般狀況

魚藤酮背部皮下注射30d后，PD模型組大鼠行為學出現明顯改變，表現為主動活動減少，活動時步態不穩多向一側偏斜等類PD樣癥狀。治療組大鼠給予銀杏葉提取物灌胃后上述癥狀有明顯改善，且高劑量組癥狀改善更加顯著。

2.2 各組大鼠紋狀體中神經炎性反應因子的改變

與對照組相比，PD模型組大鼠紋狀體組織中炎性反應因子TNF-α和IL-1β增加，差異有統計學意義(P<0.01)。銀杏葉提取物干預后紋狀體中TNF-α和IL-1β較模型明顯減少(P<0.05)，且有明顯的劑量依賴性，高劑量組較低劑量組TNF-α和IL-1β明顯減少(P<0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠腦內TNF-α和IL-1β的比較Tab.1 The content of TNF-α and IL-1β in rat brains

*P<0.05，**P<0.01vscontrol;#P<0.05vsPD group;△P<0.05vsL-EGb group;TNF-α：tumor necrosis factor-α;IL-1β:interleukin-1β;PD:Parkinson’s disease;L-EGb:low dose ginkgo biloba extract;H-EGb: high dose ginkgo biloba extract.

2.3 各組大鼠腦內星形膠質細胞和小膠質細胞標志物GFAP和Iba1的表達改變

與對照組相比，PD模型組大鼠腦組織中GFAP和Iba1表達明顯增加，差異有統計學意義(P<0.01)，銀杏葉提取物干預后GFAP和Iba1表達與模型組相比被抑制(P<0.05)，且有明顯的劑量依賴性，高劑量組較低劑量組GFAP和Iba1表達明顯減少(P<0.05)(圖1，表2)。

Con: control;PD:Parkinson’s disease;L-EGb:low dose EGb;H-EGb: high dose EGb.

表2 各組大鼠腦內GFAP、Iba1 和 NF-κB的比較Tab.2 Expression of GFAP，Iba1 and NF-κB in rat brains of each group

*P<0.05，**P<0.01vscontrol;#P<0.05vsPD group;△P<0.05vsL-EGb;NF-κB:nuclear factor-κB;PD:Parkinson’s disease;L-EGb:low dose ginkgo biloba extract;H-EGb: high dose ginkgo biloba extract.

2.4 各組大鼠中腦NF-κB的表達改變

與對照組相比，PD組大鼠中腦NF-κB表達明顯增加(P<0.01)，銀杏葉提取物干預后明顯抑制NF-κB表達(P<0.05)，且有明顯的劑量依賴性，高劑量組較低劑量組NF-κB表達明顯減少(P<0.05)(表2，圖2)。

圖2 不同劑量銀杏葉提取物對大鼠腦內NF-κB表達的影響Fig.2 The effect of different dosage of ginkgo biloba extract (EGb) for NF-κB of the rat brains

Con: control;PD:Parkinson’s disease;L-EGb:low dose EGb;H-EGb: high dose EGb.

3 討論

慢性神經炎性應激反應是各種神經退行性疾病的主要病理改變之一[8-9]。隨著年齡的老化，機體的免疫功能紊亂，導致體內炎性反應因子分泌增加，導致機體損傷，其中腦的衰老可能涉及中樞神經系統內免疫活性細胞過度激活而導致的免疫炎性反應，其病灶周圍存在大量激活的小膠質細胞和星形膠質細胞，可產生大量補體、炎性細胞因子及其他急性期反應物等，故小膠質細胞和星形膠質細胞是中樞神經系統炎性反應的關鍵靶點[10-11]。筆者的前期研究[12]顯示魚藤酮背部皮下注射可以導致大鼠腦內TH明顯減低，出現類PD樣癥狀，表明魚藤酮是一種有效制備PD動物模型的工具藥[12]。本研究中筆者發現，在PD 動物模型腦內出現小膠質細胞和星形膠質細胞的標志物GFAP和Iba1表達的明顯增加，表明小膠質細胞和星形膠質細胞被激活和誘導，同時可見PD動物模型腦內的炎性反應因子TNF-α和IL-1β的表達也明顯增加，說明PD動物模型腦內發生了明顯的神經炎性反應。

筆者前期實驗[12]證實，銀杏葉提取物能明顯增加PD大鼠模型腦內TH的表達，從而增加腦內多巴胺神經遞質的含量，改善PD大鼠模型的運動障礙癥狀。銀杏葉提取物具有多種生物學活性，在本研究中筆者進一步探討了其對PD動物模型腦內神經炎性損傷的保護作用。實驗結果證實，神經毒性物質魚藤酮誘導的PD模型腦內出現小膠質細胞和星形膠質細胞的激活。激活的小膠質細胞和星形膠質細胞會影響周圍局部組織環境中炎性反應因子TNF-α和IL-1β的釋放，同時誘導黑質神經元內的NF-κB表達增加。銀杏葉提取物能有效抑制上述炎性反應，從而減少大鼠腦內黑質多巴胺能神經元的損傷，起到腦保護作用。

NF-κB是介導許多免疫和炎性反應的中心物質，同時也是細胞凋亡信號通路中一個重要的轉錄調節因子，它主要通過調節一系列參與炎性反應及凋亡的基因轉錄來發揮作用，是慢性神經炎性反應中的關鍵蛋白[13]。本研究顯示，帕金森病大鼠腦內出現NF-κB表達明顯增加，既往研究[14]證實，NF-κB的過度激活可以誘導半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶3表達，從而加速神經細胞凋亡和壞死。本研究證實，銀杏葉提取物能有效抑制NF-κB的表達，減少炎性反應因子TNF-α和IL-1β的釋放，從而有效減少帕金森病大鼠腦內黑質多巴胺能神經元損傷，是治療PD的有效方法。

本研究證實銀杏葉提取物能有效抑制腦內小膠質細胞和星形膠質細胞的激活，減少腦內NF-κB的表達和炎性反應因子TNF-α和IL-1β的釋放，改善PD大鼠腦內的神經炎性反應，起到腦保護作用，為PD的臨床治療提供了新的靶點，同時為臨床藥物的選擇提供了新的思路。