不同濃度β1-腎上腺素受體自身抗體對心肌細胞存活影響的差異性

王兆佳 武 燁 劉 丹 王美麗 隗 歆 劉慧榮*

(1.首都醫科大學基礎醫學院生理學與病理生理學系，北京 100069；2.代謝紊亂相關心血管疾病北京市重點實驗室，北京 100069；3.首都醫科大學燕京醫學院，北京 101300)

《中國心血管病報告 2017》[1]顯示，心血管疾病是威脅我國公眾健康的主要的危險因素，呈逐年增高、居高不下的趨勢，因此研究心血管疾病、尤其是各種心血管疾病的終末階段——心力衰竭就顯得尤為重要。多種機制參與心力衰竭的發生、發展，包括：交感神經系統紊亂、心血管活性物質分泌失衡、 細胞損傷等[2]。其中交感神經系統持續興奮被證實為促進心力衰竭發生的核心機制之一[3]，其主要機制為心肌細胞β1腎上腺素能受體(β1-adrenergic receptor，β1-AR)持續激活[4]。據調查[5]，40%～60%的心功能不全患者血清中可檢測到β1腎上腺素受體自身抗體(β1-adrenergic receptor autoantibody，β1-AA)，其與β1-AR細胞外第二環特異性結合，起到類激動劑樣作用，且具有持續激活不脫敏的特點，最終損傷心肌[6]。工作的心肌高度依賴線粒體呼吸維持足夠的能量供應，而持續激活的β1-AR導致細胞代謝和線粒體呼吸異常，這可能是造成線粒體有害物質的產生并蓄積進而促進心肌細胞死亡、導致心功能不全、心力衰竭發生的原因[7]。筆者前期研究[8]顯示，β1-AA可以損傷線粒體功能，導致細胞死亡。

筆者同樣發現，除心力衰竭患者血清中存在β1-AA外，部分心功能正常的人血清中同樣存在β1-AA[9]，但是β1-AA造成的這種心功能差異機制不清。因此探尋其機制，為臨床診療上延緩甚至阻止β1-AA陽性人群心功能惡化、緩解甚至逆轉心功能不全患者提供了病理生理學基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料

H9c2細胞系(中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞中心)、具有良好生物學活性的單克隆抗體(β1-AABs)[10]、胎牛血清(FNA500，上海依科賽生物公司)、DMEM高糖培養基(10817014， Corning公司，美國)、胰蛋白酶1∶250(trypsin powder，porcine 1∶250，Sigma-Aldrich公司，美國)、Ⅱ型膠原酶(collagenase type2，Worthington公司，美國)、CCK-8法細胞增生檢測試劑盒(KGA317，南京凱基生物科技發展有限公司)、增強型ATP檢測試劑盒(S0027，上海碧云天生物技術有限公司)、線粒體膜電位檢測試劑盒(C2006，上海碧云天生物技術有限公司)、96孔不透光發光板(9502887，Thermo Scientific公司，美國)、BCA蛋白分析試劑盒(SF247582，Thermo Scientific公司，美國)。

1.2 主要儀器

全功能酶標儀(Synergy H1，BioTek公司，美國)、化學發光儀(Spectramax Molecular Devices公司，美國)、流式細胞儀(LSRFortessa，BD公司，美國)。

1.3 原代SD大鼠乳鼠心肌細胞(neonatal rat cardiomyocytes, NRCMs)提取

取數只新生SD大鼠心臟置于冰磷酸鹽緩沖液(PBS)中，去除心耳等部位，剪碎并洗去殘留血液。加入適量的胰蛋白酶與Ⅱ型膠原酶混合酶液，37 ℃水浴5 min，將混合液移至含有10%(體積分數)胎牛血清(FBS)的DMEM高糖培養基終止消化，重復上述操作，至組織消化完全。將培養基混濁液850 r/min離心5 min。棄上清，用培養基重懸細胞沉淀，差速貼壁法獲得所需細胞。

1.4 細胞培養及藥物刺激處理

用含有10%(體積分數)FBS的DMEM培養H9c2細胞至密度為60%～80%，培養NRCMs至第3～4 d時，加入β1-AA(10-10、10-9、10-8、10-7、10-6mol/L)24、36、48 h，檢測后續指標。

1.5 細胞生存率檢測

將新型細胞增生及毒性檢測溶液按照10 μL/100 μL培養基加入待測細胞中，避光培養1 h后，使用酶標儀在450nm波長處檢測吸光度(A值)。細胞生存率=(加藥細胞A值-本底A值)/(對照細胞A值-本底A值)。

1.6 細胞ATP含量檢測

吸除待測細胞培養基，按照50 μL/孔加入裂解液(24孔板)，充分裂解細胞后，4 ℃， 12 000g離心 5 min，取上清。配置ATP標準溶液、ATP檢測工作液。將工作液加入不透光的檢測孔板內，室溫放置3～5 min。再將待測樣品、ATP標準溶液加入檢測孔板內，迅速混勻，使用化學發光儀檢測熒光值，并根據標準曲線計算ATP含量。BCA法檢測細胞裂解液蛋白濃度。最終計算ATP的濃度(nmol/mg)。

1.7 細胞線粒體膜電勢檢測

根據說明書配置JC-1染色工作液。將待測細胞使用胰酶消化并收集至EP管中，加入等量的JC-1染色工作液，充分混勻后繼續培養20 min。配置JC-1染色緩沖液(1×)，使用此液洗滌細胞3次。最終使用流式細胞儀檢測。

1.8 統計學方法

2 結果

2.1 不同濃度β1-AA對心肌細胞生存率的改變

與對照組相比，采用中、高濃度(10-7、10-6mol/L)的β1-AA在不同的時間刺激，NRCMs生存率皆明顯下降(P<0.05)，其中10-6mol/L β1-AA作用36 h時最為明顯(0.18 ± 0.01vs1.00 ± 0.00，P<0.05)；其他濃度(10-10、10-9、10-8mol/L)時，NRCMs生存率與對照組相比無明顯變化(圖1A～C)(F24 h=28.57，F36 h=245.29，F48 h=45.80)。提示，中高濃度β1-AA降低乳鼠心肌細胞(NRCMs)生存率，低濃度β1-AA對乳鼠心肌(NRCMs)生存率無明顯影響。

與對照組相比，β1-AA在中高濃度(10-7及10-6mol/L)作用24 h后，H9c2細胞生存率下降，并且持續到48 h(P<0.05)，尤其值得關注的是，10-6mol/L β1-AA在作用持續48 h后，與對照組相比，H9c2細胞生存率下降尤為顯著(0.07 ± 0.01vs1.00 ± 0.00，P<0.05)；而低濃度(10-10及10-9mol/L)β1-AA刺激36 h及低濃度(10-10及10-8mol/L)刺激48 h后，H9c2細胞生存率有輕微的增加(P<0.05)，尤其是10-9mol/L β1-AA作用36 h后，與對照組相比，H9c2細胞的生存率增加最為明顯(1.24 ± 0.04vs1.00 ± 0.00，P<0.05)(圖2A～C)(F24 h=25.48，F36 h=35.90，F48 h=121.27)。提示：中、高濃度β1-AA降低H9c2細胞生存率、低濃度β1-AA增加H9c2細胞生存率。

圖1 不同濃度的β1-AA對乳鼠心肌細胞生存率的改變Fig.1 Different cell survival of NRCMs by β1-AA of different concentrations

A-C: Cell survival was detected by using CCK8 assays after NRCMs were treated by β1-AA (10-10， 10-9， 10-8， 10-7， 10-6mol/L) for 24 h， 36 h and 48 h.*P<0.05vscon group;n=3～6 per group;con: control;NRCMs:neonatal rat cardiomyocytes;β1-AA:β1-adrenergic receptor autoantibody.

圖2 不同濃度的β1-AA對H9c2細胞生存率的改變Fig.2 Different cell survival of H9c2 cells by β1-AA of different concentrations

A-C: Cell survival was detected by using CCK8 assays after H9c2 cells were treated by β1-AA (10-10， 10-9， 10-8， 10-7， 10-6mol/L) for 24 h， 36 h and 48 h.*P<0.05vscon group，n=3-6 per group，con: control；β1-AA:β1-adrenergic receptor autoantibody..

2.2 不同濃度β1-AA對H9c2細胞中ATP含量的影響

給予H9c2細胞不同濃度(10-10、10-9、10-8、10-7、10-6mol/L)的β1-AA刺激48 h(因生存率實驗筆者發現作用時間無明顯相關，后續實驗使用48 h時間點)，檢測其ATP含量。結果顯示：與對照組相比，高濃度(10-6mol/L)的β1-AA刺激后，H9c2細胞ATP含量明顯下降(0.15 ± 0.08vs1.00 ± 0.24，P<0.05)；與對照組相比，采用中、低濃度(10-10、10-9、10-8、10-7mol/L)的β1-AA刺激，H9c2細胞中ATP含量明顯增加(P<0.05)，尤其10-8mol/L β1-AA作用最為明顯(4.08 ± 0.23vs1.00 ± 0.24，P<0.05)(圖3)(F=21.06)。

圖3 不同濃度的β1-AA引起H9c2細胞ATP含量改變Fig.3 Different content of ATP of H9c2 cells by β1-AA of different concentrations

The content of ATP was detected by Enhanced ATP Assay Kit after H9c2 cells treated by β1-AA (10-10， 10-9， 10-8， 10-7， 10-6mol/L) for 48 h.*P<0.05vscon group，n=4 per group，con: control；β1-AA:β1-adrenergic receptor autoantibody.

2.3 不同濃度β1-AA對H9c2細胞線粒體膜電勢的影響

給予H9c2細胞不同濃度(10-10、10-9、10-8、10-7、10-6mol/L)的β1-AA刺激48 h，通過加載JC-1熒光探針、利用流式細胞術檢測線粒體膜電勢(即紅色熒光、綠色熒光、紅色熒光與綠色熒光的比值)改變情況。結果顯示：與對照組相比，高濃度(10-6mol/L)的β1-AA組的H9c2細胞線粒體膜電勢下降，即紅色熒光降低(0.17 ± 0.14vs1.04 ± 0.02，P<0.05)、綠色熒光增加(5.15 ± 0.56vs0.82 ± 0.07，P<0.05)、紅色/綠色熒光比值降低(0.03 ± 0.03vs1.00 ± 0.07，P<0.05)；與對照組相比，低濃度β1-AA(10-10、10-8mol/L)組H9c2細胞線粒體膜電勢增高，即紅色/綠色熒光比值增加(10-10mol/L β1-AAvs對照組：1.95 ± 0.09vs1.00 ± 0.07，P<0.05；10-8mol/L β1-AAvs對照組：1.71 ± 0.09vs1.00 ± 0.07，P<0.05)(F紅色熒光=36.18，F綠色熒光=46.38，F紅色/綠色熒光比值=30.75)(圖4)。

3 討論

心血管疾病嚴重危害我國公眾健康，其終末階段心力衰竭危害最為嚴重。β-AR在心力衰竭(heart failure，HF)的發病機制和治療中的重要性已被廣泛接受[11-12]。而心臟中主要分布β1-AR，β1-AR是G蛋白偶聯受體，通過腺苷酸環化酶(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)和蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)觸發信號傳導，增加心肌細胞的收縮性[5]。據報道[13]，人體內針對β1-AR的自身抗體(β1-AA)在心力衰竭中發揮重要作用。

研究[14-15]表明，β1-AA是特異性識別并結合β1-AR細胞外第二環(the second extracellular loop of β1-adrenoreceptor，β1-AR-ECII)天然受體構象的自身抗體，40%～60%的心功能不全患者血清中存在β1-AA[5]，其可以激活受體及其下游信號通路，發揮類激動劑樣效應[16]，最終造成心肌細胞損傷、心功能受損[17]。然而，筆者前期研究[9]顯示，除心力衰竭患者血清中存在β1-AA外，部分心功能正常的人血清中存在低水平的β1-AA，那么這是否是造成β1-AA陽性者不同心功能的原因呢？為此筆者進行了細胞實驗。為還原人體內β1-AA持續作用于心肌細胞的效果，筆者選取了生物學活性接近人心肌細胞的原代SD大鼠乳鼠(出生72 h內)心肌細胞(NRCMs)、H9c2細胞系；在時間上選擇長時間段，以模擬β1-AA在人體血清內長期存在的效應。據文獻[17]報道，β1-AA刺激NRCMs 48 h可以引起凋亡，因此筆者選取24、36、48 h時間點。筆者發現10-7、10-6mol/L β1-AA作用于NRCMs、H9c2細胞后，可以引起其生存率降低，并且隨著濃度增加， 10-6mol/L β1-AA引起的生存率降低更明顯；而且，隨著時間延長，10-7mol/L β1-AA 引起的生存率降低較為明顯，這與“升高的兒茶酚胺激活β1-AR的程度與生存率呈負相關”的報道一致[12]。可能是部分β1-AA陽性人群心功能異常的原因，即β1-AA長期中高濃度刺激下心肌細胞生存率降低、進而導致心功能異常。

圖4 高濃度β1-AA引起H9c2細胞線粒體膜電勢下降Fig.4 Decreased mitochondrial membrane potential of H9c2 cells by β1-AA of high concentration

Mitochondrial membrane potential was detected after H9c2 cells was treated by β1-AA (10-10， 10-9， 10-8， 10-7， 10-6mol/L) for 48 h and JC-1 staining.A-F:results of flow cytometry， P3 for red fluorescence and P4 for green fluorescence.G: statistical graph of the red fluorescence;H: statistical graph of the green fluorescence;I: statistical graph of ratio of the red and green fluorescence， representing the mitochondrial membrane potential；*P<0.05vscon group.n=3 per group，con: control;β1-AA:β1-adrenergic receptor autoantibody.

筆者發現10-10～10-8mol/L β1-AA作用于NRCMs后，其生存率無明顯改變，并且隨著時間延長仍然無明顯改變，這與心功能正常人群中含有β1-AA陽性者的調查一致。然而低濃度 β1-AA作用于H9c2細胞36、48 h后有輕微增生，提示低濃度β1-AA可能存在正性作用，這與“異丙腎上腺素(一種β受體激動劑)產生正性變力與變時效應”的報道[18]一致。即低濃度β1-AA對心肌細胞存在正性作用、而中高濃度則引起心肌細胞過度工作而失代償終致心功能異常。

心臟維持全身各器官、組織充足的血液供應，為維持其功能，需要高度耗能，而心肌90%以上的能量來自于線粒體[19]。ATP在能量代謝中起核心作用，由線粒體氧化磷酸化產生，其含量可直接反映線粒體功能。有文獻[7]顯示，β1-AR激活會增加細胞代謝和線粒體供能，本研究結果表明，10-10～10-7mol/L的β1-AA 顯著增加H9c2細胞ATP含量，提示中低濃度β1-AA增加ATP，可能致心肌細胞收縮功能增加，起到正性肌力作用。10-7mol/L的β1-AA引起細胞生存率下降，而整體ATP含量仍為增加，提示此濃度下β1-AA引起心肌存活降低，心功能仍然正常，可能是因ATP增加所代償。10-10～10-7mol/L的β1-AA刺激的結果皆進一步解釋了β1-AA陽性者人群存在心功能正常的現象。有文獻[7]顯示，β1-AR過度活化會增加線粒體有害物質產生，進而損傷線粒體，最終致心肌細胞死亡。 10-6mol/L β1-AA刺激結果說明高濃度β1-AA損傷線粒體功能，這也進一步提示部分β1-AA陽性人群中心功能異常的可能是因為心肌ATP生成明顯減少、最終心臟因能量不足而發生功能異常。

線粒體膜電勢(mitochondrial membrane potential，MMP，ΔΨm)是線粒體健康的重要指示因子，因ΔΨm的維持需要線粒體呼吸鏈電子傳遞正常、即線粒體氧化功能正常[20]，也因ΔΨm可以驅動ATP合酶生成ATP、即線粒體磷酸化正常，起到將線粒體氧化與磷酸化偶聯的重要作用。JC-1是一種常用的ΔΨm檢測熒光探針，在線粒體膜電位較高時， JC-1聚集在線粒體的基質(matrix)中，形成聚合物(J-aggregates)，可以產生紅色熒光；在線粒體膜電位較低時， JC-1不能聚集在線粒體的基質中，此時JC-1為單體(Monomer)，可以產生綠色熒光；因此通過熒光顏色的轉變來檢測線粒體膜電位的變化，用紅綠熒光的比值來衡量線粒體去極化程度。利用流式細胞術檢測線粒體膜電勢情況，高濃度(10-6mol/L)的β1-AA嚴重損傷線粒體功能(ΔΨm下降)，與細胞生存結果、ATP含量結果一致，提示部分β1-AA陽性人群中心功能異常的可能是因為心肌線粒體功能障礙、最終心肌細胞死亡；低濃度(10-10、10-8mol/L)β1-AA刺激使得線粒體膜電勢增高(10-9、10-7mol/L有增高的趨勢)，與ATP含量的結果相符，文獻[21-22]報道，具有高運動能力的精子都具有更高的線粒體膜電勢，提示高膜電勢使得細胞具有更好的能量儲備，低濃度β1-AA刺激使得細胞因增加膜電勢而具有較好的能量儲備、產生更多的ATP，進一步解釋了部分β1-AA陽性者心功能正常的現象。

本文利用不同濃度β1-AA長時間刺激NRCMs、H9c2細胞，以模擬β1-AA在不同人群中的心功能表現，以期解釋人群中β1-AA陽性者心功能不同的可能原因，為臨床診療提供一定的病理生理學基礎，即對于β1-AA陽性人群中心功能異常患者，可以采用去除或降低血清中β1-AA含量，亦可將保護線粒體功能、維持線粒體膜電勢、提高ATP生成作為可能的治療方向，對于心功能正常人群中β1-AA陽性者，實時監測β1-AA濃度和心功能，并且通過多種方法提高心肌線粒體功能，達到三級預防的效果，以此降低我國心血管疾病發病率和致死率，改善人民生活質量。