健脾理氣方對功能性消化不良大鼠十二指腸MLCK和PGE2-cAMP通路的影響

趙魯卿 常雄飛 張聲生*

(1.首都醫科大學附屬北京中醫醫院消化中心，北京 100010；2.北京中醫醫院順義醫院脾胃病科，北京 101300)

功能性消化不良(functional dyspepsia， FD)是臨床最常見的消化系統疾病，且發病率呈逐年上升的趨勢，但病情反復遷延，耗費大量的醫療資源[1]。傳統觀點認為，消化不良癥狀主要由胃產生，近年來越來越多的研究[2-3]表明，十二指腸黏膜屏障受損在FD發生的病理生理過程中起著非常重要的作用，而緊密連接是十二指腸機械屏障的重要組成部分，對于黏膜屏障功能的發揮至關重要。目前本病的病因及發病機制尚未完全闡明，臨床西醫沒有特效藥物，多以臨時緩解癥狀為主，中醫藥通過整體調節和辨證論治，對于本病具有良好療效。FD屬中醫“痞滿”、“胃脘痛”范疇，本病病位在胃，主要涉及肝、脾二臟。“肝脾相關”理論在本病機制中尤為重要，肝為發病的重要因素，脾則為發病的關鍵環節，肝郁則氣滯，脾損多脾虛，“脾虛氣滯”是 FD的主要病理機制，本科結合多年臨床經驗創制中藥健脾理氣方，前期通過大規模隨機對照研究[4]顯示，該方可明顯改善 FD 患者的消化道癥狀。并且，本研究前期動物實驗結果表明健脾理氣方可以修復FD 大鼠十二指腸緊密連接蛋白表達，但該作用涉及的信號通路尚不清楚。

研究[5-6]顯示，肌球蛋白輕鏈激酶(myosin light chain kinase， MLCK)和前列腺素E2 (prostaglandin E2，PGE2)及其受體1(EP1)和4(EP4)介導的環磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate， cAMP)/激酶A(protein kinase A，PKA)通路是影響緊密連接蛋白結構和功能的重要因素。本研究擬從以上兩通路著手探討健脾理氣方可能的作用機制，以期發現新的治療靶點，從分子生物學水平為中醫藥的推廣奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 藥物

由首都醫科大學附屬北京中醫醫院草藥房提供(所有藥材均從北京杏林藥業公司購入)，制備水煎劑，簡要過程如下：按健脾理氣方組成(黨參、茯苓、炒白術、姜厚樸、砂仁、元胡等)稱取藥物，每付共計91 g，加入蒸餾水1 500 mL，浸泡30 min，大火將水煮沸，煎煮約30 min，將藥汁倒出盛入容器中，再次加入1 500 mL蒸餾水，煎煮第二遍，將兩次的藥液合并混勻，濃縮至95 mL，計算其生藥含量為0.96 g/mL。

1.2 實驗動物

由北京維通利華實驗動物有限公司購入SPF級雄性SD大鼠(200±20)g 18只，飼養于中國中醫科學研究院基礎所屏障級實驗動物室，實驗動物許可證號：SYXK(京)2016-0021。所有動物都在恒濕(65%～70%)、恒溫(22±1) ℃環境下飼養，每日光照12 h，所有動物均可自由飲食飲水。適應性飼養3 d后開始進行造模。

1.3 試劑及儀器

CFX 96 PCR儀(Bio-Rad公司，美國)，GoScript Reverse Transcription System( Promega公司，美國) 、GoTaq Qpcr Master Mix( Promega公司，美國)、Trizol Reagent(Cat15596-026)、cAMP Elisa試劑盒(BlueGene公司，中國)、PGE2 Elisa試劑盒(E02P0012，BlueGene公司，中國)、酶標儀(EON，BioTek instruments公司，美國)等。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物分組

將18只SD雄性大鼠采用數字表法按照1∶2比例隨機分為正常組6只、造模組12只。造模完成后，將造模組大鼠隨機分為模型組及健脾理氣方治療組，每組6只。

1.4.2 造模方法

采用目前國內公認的FD造模方法，即夾尾造模方法，具體操作如下：將造模組大鼠5只一籠分籠，用長柄海綿鉗夾緊大鼠尾巴遠端1/3處，使其暴躁惱怒，并且與同籠大鼠廝打，使整籠大鼠始終處于應激狀態。每次刺激持續30 min，每3 h刺激1次，每日刺激4次，連續刺激1周。造模期間，如果發現大鼠尾巴有破損，需要用碘酊對破損部位進行消毒，防止感染。

1.4.3 灌胃給藥

參照《現代醫學實驗動物學》[7]中動物給藥劑量規范，換算出大鼠給藥劑量為9.6 g·kg-1·d-1，即每100 g體質量大鼠，給藥量為1 mL。造模完成后，給予正常組及FD模型組大鼠0.9%(質量分數)氯化鈉注射液灌胃，每100 g體質量大鼠灌胃1 mL，而治療組大鼠給予健脾理氣方水煎劑灌胃，每100 g體質量大鼠灌胃1 mL。每日早晨8點準時灌胃，每日給藥1次，連續給藥7 d。

1.4.4 取材

實驗前24 h，將各組大鼠均禁食(不禁水)。實驗當天，將各組大鼠腹腔注射2%(質量分數)戊巴比妥鈉麻醉，后逐層剪開皮膚、肌肉，暴露十二指腸，剪取大鼠幽門下0.5 cm后約3 cm的十二指腸組織，按實驗方法的不同對新鮮組織進行處理：①置于 4%(質量分數)多聚甲醛中固定；②完全浸泡在RNA保護液中，保存于-80 ℃中備用；③放入凍存管，置于液氮中，后轉移至-80 ℃冰箱保存，用于ELISA檢測。

1.5 檢測方法

1.5.1 HE染色

剪取大鼠十二指腸組織，置于4%(質量分數)多聚甲醛中固定，脫水、包埋、切片，厚度 8 μm; 用二甲苯溶液脫蠟，依次進行蘇木精及伊紅染色液染色，經二甲苯透明后使用中性樹膠封片。

1.5.2 qPCR

取大鼠十二指腸組織，Trizol 法提取組織總RNA，按照 GoScript Reverse Transcription System 試劑盒說明書將 RNA 反轉錄為 cDNA，隨后按照 GoTaq Qpcr Master Mix 試劑盒說明書進行 qPCR 反應: 95 ℃預變性2 min，隨后進行40 個循 環: 95 ℃ 變性 15 s，60 ℃ 退火/延伸 60 s。采用 2-ΔΔCt進行 RNA 相對表達量分析。MLCK 上游引物: 5′-GACGTGTTCACCCTGGTTCT-3′，下游引物5′-TTTGTGCAGCATCAGTGACA-3′；EP1上游引物：5′-ACTTGGTGTTTCATTAGCCTT-3′，下游引物：5′-GGCCGCTGCAGGGAGTTAGAG-3′，EP4上游引物: 5′-TCTCTGGTGGTGCTCATCTG-3′，下 游 引 物: 5′-ATTCTGATGGCCTGCAAATC-3′。

1.5.3 ELISA法

將十二指腸組織從-80 ℃冰箱中迅速取出，剪刀迅速剪碎，加入500 μL預冷PBS溶液，置于自動勻漿機中進行組織研磨勻漿；使用低溫離心機，4 ℃，10 000g離心10 min，取上清液為待測樣品；將適量待測樣品用于BCA蛋白定量，得出待測樣品蛋白濃度( μg/μL)。根據ELISA試劑盒說明書進行檢測。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 三組大鼠十二指腸形態學比較

HE染色顯示，治療結束時3組大鼠十二指腸上皮黏膜結構完整，細胞排列整齊，無明顯炎性反應表現，詳見圖1。

圖1 三組大鼠十二指腸組織形態Fig.1 Morphology of duodenum(HE staining，100×)A：normal group; B:model group; C:JPLQ group; JPLQ:Jianpi Liqi.

2.2 三組大鼠十二指腸MLCK mRNA表達水平

模型組大鼠十二指腸MLCK的mRNA含量較正常組明顯升高(P<0.01)，而健脾理氣方治療后，其mRNA含量明顯下降(P<0.01)，詳見表1。

表1 大鼠十二指腸MLCK mRNA表達量Tab.1 mRNA expression of MLCK in the duodenum

F=15.943，P=0.000；**P<0.01vsnormal group;##P<0.01vsmodel group;MLCK:myosin light chain kinase;JPLQ:Jianpi Liqi.

2.3 三組大鼠十二指腸PGE2含量

與正常組相比，模型組大鼠十二指腸的PGE2含量明顯下降(P<0.01)，而經過健脾理氣治療后，其PEG2含量得到明顯升高(P<0.01)，詳見表2。

表2 大鼠十二指腸PGE2含量Tab.2 Concentration of PGE2 in the duodenum

F=28.031，P=0.000；**P<0.01vsnormal group ;##P<0.01vsmodel group;PGE2:prostaglandin E2;JPLQ:Jianpi Liqi.

2.4 三組大鼠十二指腸EP1和EP4 mRNA表達

PGE2受體有EP1-EP4四種亞型，其在消化道中均有表達，而PGE2主要通過EP1與EP4受體對腸道緊密連接蛋白的表達起到調控作用。研究結果顯示，EP1 mRNA的表達在3組中差異無統計學意義，而EP4 mRNA模型組的表達量明顯下降(P<0.05)，治療組明顯升高，與模型組比較差異有統計學意義(P<0.05)，詳見表3。

表3 大鼠十二指腸EP1/EP4 mRNA相對表達量Tab.3 mRNA expression of EP1 and EP4 in the duodenum

*P<0.05vsnormal group ;#P<0.05vsmodel group;JPLQ:Jianpi Liqi.

2.5 三組大鼠十二指腸cAMP含量

模型組大鼠十二指腸cAMP含量相較于正常組顯著降低(P<0.01)，而治療組大鼠cAMP含量顯著升高(P<0.01)，詳見表4。

表4 大鼠十二指腸cAMP含量Tab.4 Concentration of cAMP in the duodenum

F=45.593，P=0.000；**P<0.01vsnormal group ;##P<0.01vsmodel group;cAMP：cyclic adenosine monophosphate；JPLQ:Jianpi Liqi.

3 討論

FD由于發病機制并不明確，目前沒有特效藥物。中醫認為脾與胃相表里， 五行屬土，主受納運化水谷。肝在五行屬木，主疏泄， 條暢全身之氣機。“食氣入胃， 全賴肝木之氣疏泄之， 而水谷乃化”， “脾土賴肝木之疏達之性，肝木亦靠脾土灌溉而升。”思慮太過則肝氣郁滯， 疏泄不及則脾胃升降之氣也因之而壅阻，雍滯日久則脾氣虛損，功能失司，而見諸癥。因此脾虛氣滯是本病的核心病理環節，治法以健脾和胃，理氣止痛為主。健脾理氣方由黨參、茯苓、炒白術、姜厚樸、砂仁、元胡等組成，諸藥配伍補消兼施，升降有制，既能健運脾胃又可調理氣機，虛可補，滯可行，共奏健脾和胃、理氣止痛之效，該方臨床療效確切，但是作用機制并不明確。近年來，十二指腸黏膜屏障受損等關于FD的新的發病機制被提出，“脾為之衛”，脾虛則衛外功能失司，就消化道而言與現代腸道黏膜屏障功能理論相吻合。十二指腸是否是中醫藥作用的靶點，目前研究較少。

研究[2]表明，FD 患者十二指腸跨上皮電阻抗較低，細胞旁通透性增加，提示十二指腸黏膜完整性受損。緊密連接是十二指腸黏膜上皮細胞之間的主要連接方式，對上皮細胞屏障功能的正常發揮起著重要作用[4]。緊密連接蛋白的結構和功能受多條通路調節。MLCK屬于鈣調蛋白依賴的蛋白激酶家族，在鈣和鈣調蛋白存在下，MLCK對肌球蛋白輕鏈進行磷酸化作用，并促進肌球蛋白與肌動蛋白之間相互作用，促進肌動蛋白收縮，進而破壞細胞間緊密連接，引起細胞通透性升高[5，8]。該研究結果顯示，健脾理氣方可以降低FD大鼠十二指腸MLCK mRNA表達量。PGE2具有保護腸道緊密連接屏障的作用[9]，既往的基礎研究[10-11]顯示，PGE2對十二指腸緊密連接蛋白表達的調控，主要通過與EP1及EP4結合起作用。PGE2與其受體結合后，細胞內cAMP含量升高，PKA則由cAMP激活，對緊密連接蛋白裝配以及上皮細胞旁通路的開放具有調節作用[12]。結果顯示，健脾理氣方可以提高FD大鼠十二指腸PGE2和cAMP的表達，提高EP4的mRNA表達量。前期相關藥理研究[13-14]結果顯示，健脾理氣方中藥物有效成分白術多糖可以修復腸道黏膜屏障[13]，甘草總黃酮可以促進PGE2分泌[14]。

綜上所述，健脾理氣方抑制MLCK，激活PGE2-EP4-cAMP/PKA信號通路，進一步改善FD模型大鼠十二指腸緊密連接蛋白結構和功能，恢復十二指腸黏膜屏障功能，可能是其治療FD 的作用機制之一。