2，4-表油菜素內酯緩解水稻花期高溫脅迫的生理機制

高健 王亞梁 孫磊 趙淵 劉連盟 侯雨萱 王玲黃世文

（中國水稻研究所/水稻生物學國家重點實驗室，杭州310006；*通訊作者：wangling03＠caas.cn；huangshiwen＠caas.cn）

自從工業革命以后，CO2排放量增加，地表溫度不斷上升。IPPC（2013）報告指出，在100多年來，全球地表平均溫度升高了0.85℃，預計未來100年左右，溫度大約會再提高0.3℃～4.8℃[1]。據估計到21世紀末，溫度上升可能使我國水稻的產量降低41%[2]。長江中下游地區是我國主要的水稻種植區域，該地區水稻受到高溫的影響非常明顯。有研究表明，2017年合肥市水稻開花期在7月22日至28日期間遇到38℃以上的高溫，導致部分水稻品種的結實率下降15%～25%[3]。在水稻的生育期中，花粉母細胞減數分裂期和開花期對高溫脅迫最敏感，在這兩個時期內遭遇高溫，會導致水稻產量顯著下降[4-5]。

目前，培育耐熱型水稻品種是抵御高溫最重要的方法，耐熱品種受高溫脅迫傷害較小，易形成大穗，結實率高[6]。同時，調整栽培措施也是一種重要的農藝措施。比如，分期播種錯開水稻花期高溫，或者高溫逆境時進行深水灌溉[6-7]。但是耐熱型水稻品種少，培育耐熱型水稻品種時間緩慢，而調整栽培措施也會產生一些問題，比如，調整播期能夠避開高溫，但避開高溫的同時可能增大病蟲害發生的可能，因此，噴施化學調控劑不失為一種有效的方法[8-9]。已報告能減輕植物高溫傷害的化學調節劑有激素類、滲透壓調節劑、抗氧化劑、信號分子、多胺和微量元素等[10]。與其他類型的化學調節劑相比，激素類在植物抗逆方面的作用更為明顯。已有研究表明，噴施水楊酸、茉莉酸甲酯等植物激素可通過提高植物的抗氧化酶活性、光合作用以及可溶性糖含量等來避免或減輕作物受到高溫傷害[6，11]。

油菜素內酯（Brassinosteroids，BRs）是多羥基化類固醇類植物激素，能影響植物對外界信號的反應，在植物生長發育方面有著重要作用。BRs不僅能影響植株大小、雄性生育力、開花和光合作用等[12-13]，而且可能會增加各種生物和非生物逆境的適應性[12，14]，被認為是“輔助植物修復”的潛在激素。2，4-表油菜素內酯（EBR）是BRs的一種，在減輕植物高溫脅迫方面有著優良的效果。謝云燦等[13]研究表明，噴施EBR不僅能改善大豆品質，還能減輕大豆高溫脅迫下的傷害，提高產量。張永平等[15]研究表明，EBR有利于高溫脅迫下甜瓜幼苗抗氧化酶活性的提高和對光能的捕獲與轉換，對甜瓜幼苗的生長有利。BRs在其他作物耐熱性方面的研究已有一定的報道，但是在緩解水稻高溫逆境方面的研究甚少。本研究以耐熱型水稻品種黃華占為試驗材料，探究2，4-表油菜素內酯緩解水稻高溫熱害的作用機制，為化學調控減輕水稻高溫傷害提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 參試材料

供試水稻品種為耐熱型品種黃華占[16]。

1.2 試驗設計

在水稻破口期，將盤栽苗移入人工氣候箱進行高溫脅迫處理。高溫處理為：0∶00-7∶00，31℃；7∶00-9∶00，32.5℃；9∶00-14∶00，38℃；14∶00-16∶00，36.5℃；16∶00-24∶00，31℃。常溫對照處理為：0∶00-7∶00，25℃；7∶00-9∶00，26.5℃；9∶00-14∶00，32℃；14∶00-16∶00，30.5℃；16∶00-24∶00，25℃。人工氣候箱中的相對濕度控制在75%左右。高溫處理5 d后，將水稻植株移置自然環境下。

本試驗共設4個處理：NT-CK，常溫噴施清水；NT-EBR，常溫噴施 0.55 mg/mL 的 EBR；HT-CK，高溫脅迫下噴施清水；HT-EBR，高溫脅迫下噴施0.55 mg/mL的EBR。在水稻花粉母細胞減數分裂中后期進行藥劑噴施處理，每隔3 d噴1次，共噴施3次，每次噴到藥液在葉片自然滑落為止。每個處理3次重復。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 花粉表型觀察和產量因素

于高溫處理后第3 d，從每穗上、中、下部位各取3個穎花，用1%I2-KI溶液染色在熒光顯微鏡下（OLYMPUS，BX61）觀察花粉活力，取所有當天開花的穎花在體式顯微鏡下（OLYMPUS，SZX9）觀察花藥破裂率，計算花粉育性和花藥破裂率[花粉活力（%）=染色花粉粒數/花粉粒總數×100；花藥破裂率（%）=（待測花藥數-未破裂花藥數）/待測花藥數×100]。每個處理3次重復。于水稻成熟后，收取20個穗子，考查千粒重、每穗總粒數和實粒數。每個處理3次重復。

1.3.2 相關生理指標

高溫處理第3 d，取新鮮穎花用于生理指標的測定。超氧化物歧化酶（SOD）活性測定采用Giannopolitis和Ries的方法[17]；POD活性測定采用Maehly和Chance的方法[18]；CAT活性測定采用李仕飛等的方法[19]；丙二醛含量的測定采用Dhindsa等方法[20]；脯氨酸含量的測定采用張殿忠的方法[21]；可溶性糖含量的測定用蒽酮比色法[22]。

1.3.3 內源激素含量

高溫處理3 d后，采用符冠富等的方法[7]測定內源激素含量。稱取0.1 g穎花鮮樣，加4℃放置的1 mL提取液（80%甲醇中含有1 mmol/L二叔丁基甲苯酚），冰上勻漿后，4℃提取4 h，4℃ 10 000 r/min離心10 min，定容5 mL，安捷倫C18SPE處理后氮吹，用樣品稀釋液溶解，采用酶聯免疫吸附法（Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay，ELISA）測定ABA和GA含量。

1.3.4 ABA合成相關基因OsNECD2的表達分析

高溫處理3 d后，取穎花鮮樣，用常規TRIGOL法提取RNA。cDNA的合成用TaKaRa的實時定量反轉錄試劑盒（PrimeScriptTM RT Master Mix），使用Applied Biosystems公司的ABI7900進行相關基因表達量的測定。PT-PCR運行程序：預變性95℃ 1.5 min；95℃ 10s，60℃ 30 s，72℃ 20 s，40 個循環。采用 2-△△CT進行相對表達量的計算。OsNECD2的上游引物序列5’-AGCACAGAGGATTGCACCATT-3’，下游引物序列 5’-TGTTGTCTCCAAGCCTTGATTT-3’；內參基因ubi的上游引物序列 5’-GCTCCGTGGCGGTATCAT-3’，下游引物序列 5’-CGGCAGTTGACAGCCCTAG-3’。

1.4 統計分析

采用 Microsoft Excel 2010和SAS 9.2進行數據的統計和分析，用Duncan’s法檢驗處理間差異。

2 結果與分析

2.1 噴施EBR對產量構成因素的影響

從表1可見，與常溫對照相比，高溫脅迫后水稻結實率降低42.79%，而對每穗總粒數、千粒重沒有顯著影響；在常溫下，噴施EBR對結實率、穗總粒數以及千粒重均無顯著影響。高溫脅迫下，噴施EBR相對噴施清水使水稻結實率提高了24.09%，而噴施EBR對穗總粒數和千粒重無顯著影響。

2.2 噴施EBR對花粉活力以及花藥開裂的影響

花粉活力和花藥開裂率是影響水稻結實的重要因素。各個處理下的花粉活力以及花藥開裂率的調查表明，與常溫對照相比，高溫脅迫后水稻花藥開裂率降低36.87%，穗子中、下部位的花粉活力分別降低8.38%和21.1%；在常溫下，噴施EBR對花粉活力和花藥開裂并無顯著影響。在高溫脅迫下，噴施EBR相對噴施清水，花藥開裂率提高55.4%，穗子中部和下部的花粉活力分別提高了8.64%和24.2%（表1）。

2.3 對抗氧化酶的影響

SOD、POD、CAT能清除植物體內產生的活性氧（ROS），防止膜脂質過氧化。測定結果表明，與常溫對照相比，在高溫脅迫下SOD、POD、CAT的酶活性分別上升了29.83%、101.37%和91.73%，常溫下噴施EBR后SOD的酶活性提高了51.76%，對POD和CAT無顯著影響。高溫脅迫下，噴施EBR相對噴施清水SOD、POD酶活性分別上升了20.4%和30.9%，對CAT無顯著影響（表2）。

表1高溫脅迫下EBR對水稻產量及花粉育性的影響

表2高溫脅迫下EBR對水稻生理指標的影響

2.4 對丙二醛含量的影響

MDA是評價脂膜受損程度的指標之一。測定結果表明，與常溫對照相比，高溫脅迫下MDA含量顯著上升54.77%，常溫下噴施EBR MDA降低了36.23%；高溫脅迫下噴施EBR相對噴施清水MDA下降了25.14%（表 2）。

2.5 對可溶性糖和脯氨酸含量的影響

可溶性糖和脯氨酸的積累有助于保持細胞滲透平衡。測定結果表明，與常溫對照相比，高溫脅迫下可溶性糖和脯氨酸的含量顯著上升了46.23%和45.13%，常溫下噴施EBR后可溶性糖和脯氨酸含量升高了41.34%和38.57%；而高溫脅迫下噴施EBR后可溶性糖和脯氨酸含量分別提高8.23%和11.02%（表2）。

2.6 對GA和ABA含量的影響

植物激素間的相互作用可以調控植物的生長發育。測定結果表明，與常溫對照相比，高溫脅迫下GA含量下降12.54%，ABA含量上升39.25%，常溫下噴施EBR后GA含量下降20.69%，ABA含量上升了32.27%；高溫脅迫下，噴施EBR后GA含量下降18.81%，ABA含量上升7.48%（表2）。

2.7 對ABA合成基因OsNCED2表達量的影響

OsNCED2是控制ABA的合成代謝途徑的關鍵基因。基因表達量分析表明，與常溫對照相比，高溫脅迫下，OsNCED2表達量上升305.16%，常溫下噴施EBR后OsNCED2表達量上升了181.58%；高溫脅迫下，噴施EBR后OsNCED2表達量上升30.67%（表2）。

3 討論

花粉的萌發、授粉、花藥開裂等生理活動易受到高溫影響，從而導致水稻的敗育，結實率下降，產量降低。高溫脅迫下，穎花觀察是高溫指標中的重要因素。張桂蓮等[23]的研究發現，在高溫脅迫下，水稻花藥開裂受到抑制，花粉粒數減少，花粉活性降低，導致小穗育性降低，結實率下降，這與本研究的結果一致。在本研究中，常溫下噴施EBR對花粉活力、花藥開裂無顯著影響，而高溫脅迫下噴施EBR能使水稻花藥和穗子中、下部位的花粉的活性提高，有利于水稻結實，這說明高溫脅迫下花粉育性的提高是由于噴施了EBR的緣故，EBR有助于維持水稻本身的抗逆性。

高溫脅迫會導致植物體內的活性氧（ROS）的過量產生[24]，如超氧自由基（O2-）、羥基自由基（OH）和過氧化氫（H2O2）等，導致膜脂質過氧化，蛋白質變性和核酸損傷[25]。為了阻止高溫脅迫下ROS對細胞的損害，植物中的一系列的抗氧化活性酶，包括SOD、、POD、CAT、APX，以及AsA和GSH等非酶系統的活性上升，可能有效的清除ROS，防止膜脂質過氧化，減輕高溫傷害[26-27]。在本研究中，噴施EBR誘導了水稻SOD和POD的酶活性增加，有助減輕高溫下ROS積累帶來的損傷。然而，尚不清楚EBR是否直接或間接調節植物對氧化應激的反應[28]。

在脅迫條件下的植物已經進化出在胞質溶膠中積累相容的滲透物用于細胞內維持滲透穩態，這些滲透物包括脯氨酸、可溶性糖以及可溶性蛋白[25]。這些滲透物不僅在滲透調節中起作用，其中脯氨酸還能參與氮代謝、能量代謝以及保護生物大分子，可溶性糖能保持細胞膜和原生質膠體的穩定，并為有機物的合成提供碳架[29]。高溫逆境提高了脯氨酸和可溶性糖含量，EBR處理促進了這兩種滲透保護劑的積累，表明EBR可能會促進滲透物的積累，這可能與這些植物的耐熱性提高密切相關。

植物激素間的相互作用可以調控植物的生長發育，已有眾多研究揭示了BR和其它激素的相互作用[30-31]。GA和BR都是促進生長的激素，但是它們之間存在拮抗關系[32]。有研究表明，在水稻根部，當施加過量活性BR時，該激素主要通過GA失活基因GA2ox-3的上調誘導GA失活，導致激素水平降低和生長抑制[33]。DELLA家族蛋白，在GA信號分子中在N端具有DELLA結構域的蛋白。有研究表明，GA含量的降低有利于DELLA的積累，并且DELLA家族蛋白在環境壓力下能參與植物適應性生長[34]。在本研究中，外源EBR的處理使得GA含量降低，這可能是外源EBR使水稻能維持較高抗逆性的原因。ABA可以增強抗氧化酶活性、調節光合作用、促進細胞吸水、調節氣孔、緩解逆境傷害[35-37]。而高溫處理可以使ABA含量增加[38]，從而調整植物適應高溫脅迫。OSRK1/SAPK6和SAPK4參與ABA信號傳導，而噴施EBR可能通過影響這些蛋白磷酸化水平來影響ABA信號傳導[39]。在本研究發現，噴施EBR GA含量下降，ABA含量上升，這說明EBR能通過內源激素的變化來達到減輕高溫對水稻的傷害的目的。

9-順-環氧類胡蘿卜素雙加氧酶（NCED）是水稻和擬南芥ABA生物合成的限速酶，在水稻中存在5個NCED基因，包括OsNCED1、OsNCED2、OsNCED3、Os-NCED4和OsNCED5，其中僅有OsNCED3基因表達受干旱脅迫誘導[40]，但是在我們的研究中，高溫可以誘導OsNCED2基因的表達，噴施EBR進一步誘導Os-NCED2的表達，OsNCED2是否是高溫下ABA的生物合成關鍵基因以及噴施EBR是否是影響OsNCED2的表達進而提高ABA的含量還需進一步研究。

4 結論

本研究表明，在高溫脅迫下，噴施EBR能通過提高抗氧化酶的活性、滲透保護劑的積累，以及內源激素的調節，來維持花粉育性和花藥的正常，從而減輕高溫對水稻結實的傷害。本研究提供了EBR緩解水稻高溫傷害的技術支持，對高溫逆境下水稻的保產措施有著參考作用。