植物精油與硫酸粘桿菌素對不同菌株抗耐藥性研究

◆作者：張修坤 呂勇 沈兆艷 吳世林

◆單位：廣州智特奇生物科技股份有限公司，廣東廣州510000

抗生素可通過非選擇性抑菌或殺菌，消除腸道有害微生物對動(dòng)物生長的抑制作用（吳迪等，2010）。抗生素應(yīng)用在畜禽生產(chǎn)中，可避免因幼仔免疫力不足、消化系統(tǒng)發(fā)育不健全而帶來的健康問題，從而降低幼仔的發(fā)病率和死亡率（魏磊等，2016）。但是細(xì)菌的耐藥性目前正受到公眾越來越多的關(guān)注，隨著抗生素被濫用和可對多種抗生素產(chǎn)生耐藥性的“超級細(xì)菌”的不斷出現(xiàn)，細(xì)菌的耐藥性所產(chǎn)生的危害越來越明顯，且很難被控制（韓飛等，2016）。尤其是在畜牧生產(chǎn)方面，抗生素的副作用已經(jīng)嚴(yán)重威脅到了消費(fèi)者的健康和生命安全。細(xì)菌耐藥性這一問題的解決有很多途徑，但是研發(fā)新的抑菌劑是非常有效的一個(gè)方法（賈愛卿等，2006）。植物提取物因其具有抑菌、滅菌、易被消化分解等優(yōu)點(diǎn)，而被作為新型飼料添加劑的研究熱點(diǎn)（CHANG等，2001）。

植物精油可作為抗生素的替代品用于畜禽業(yè)生產(chǎn)，采用合理的試驗(yàn)方法評估驗(yàn)證植物精油的抗耐藥性，對改進(jìn)和推廣植物精油產(chǎn)品是十分必要的。本實(shí)驗(yàn)利用瓊脂平板法來測定植物精油與硫酸粘桿菌素對不同世代、不同分離源的野生大腸桿菌和乳酸菌的最低抑菌濃度，比較植物精油與硫酸粘桿菌素的抗耐藥性。

1 試驗(yàn)材料

1.1 抗生素和植物精油

硫酸粘桿菌素為市場中所購，含量為10%，植物精油（智然香，3.5%）由廣州智特奇生物科技股份有限公司提供。

1.2 供試菌種

野生型的大腸桿菌、乳酸菌，由本實(shí)驗(yàn)室分離保存；標(biāo)準(zhǔn)型腸桿菌、乳酸菌，購買自廣東省微生物研究所。

1.3 儀器

恒溫恒濕箱：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；SW-CJ-IG型單人凈化工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；DHG-924OA電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；不銹鋼手提式蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；FA2004電子天平 (感量0.0001 g)：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；培養(yǎng)皿、試管、移液槍、接種環(huán)等。

1.4 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10.0g，牛肉粉膏5.0g，酵母粉4.0g，葡萄糖 20.0g，吐溫 80 1.0mL，磷酸氫二鉀 2.0g，乙酸鈉 5.0g，檸檬酸三銨 2.0g，硫酸鎂 0.2g，硫酸錳 0.05g，瓊脂粉 15.0g，蒸餾水1000mL，將上述成分加人蒸餾水中，加熱溶解，校正pH6.8，分裝后121℃高壓滅菌15～20min。

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：蛋白胨10.0g，牛肉膏粉3.0g，氯化鈉5.0g，瓊脂 15.0g，將上述成分加人蒸餾水中，加熱溶解，校正pH 7.1～7.5，分裝后121℃高壓滅菌15 ～20 min。

伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基：蛋白胨10.0g，乳糖 10.0g，磷酸氫二鉀2.0g，瓊脂 20～30g，蒸餾水1000mL，l2%伊紅水溶液20mL，0.5%美藍(lán)水溶液13 mL，pH 7.3。

2 方法

2.1 菌株的分離

收集仔豬的新鮮糞便，加入已滅菌并冷卻的蒸餾水進(jìn)行稀釋，將不同梯度的稀釋液接種于伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基和MRS鑒別培養(yǎng)基，進(jìn)行初步篩選。當(dāng)有肉眼可觀察的菌落出現(xiàn)后，用接種針挑取符合要求的菌落，然后進(jìn)行生化試驗(yàn)進(jìn)行菌種鑒定（王紅寧等，2000）。

2.2 菌懸液的配制

將鑒定后的野生型菌株和實(shí)驗(yàn)室保存的標(biāo)準(zhǔn)型菌株接種至已滅菌并冷卻的緩沖蛋白胨水液體培養(yǎng)基和MRS液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)。分別吸取以上供試菌液0.5 mL，加入無菌水倍比稀釋到 105～106cfu/mL，備用。

2.3 植物精油與硫酸粘桿菌素最低抑菌濃度的測定

用瓊脂平板法測定各植物精油與硫酸粘桿菌素的最低抑菌濃度（MIC）；稀釋植物精油與硫酸粘桿菌素，用移液槍吸取各稀釋液0.5 mL，加入培養(yǎng)皿中，再加入滅菌完畢并冷卻至50℃左右的培養(yǎng)基，振蕩混合，靜置，植物精油濃度為1.5%、1.6%、1.7%、1.8%、1.9%、2.0%、2.1%、2.2%、2.3%、2.4%，硫酸粘桿菌素濃度為0.7%、0.8%、0.9%、1.0%、1.1%、1.2%、1.3%、1.4%、1.5%、1.6%、1.7%、1.8%、1.9%、2.0%、2.1%、2.2%、2.3%，每組3個(gè)平行。待培養(yǎng)基凝固后，利用涂布棒將菌液涂布均勻。倒置于35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后，觀察測試菌種的生長情況，完全無菌落生長時(shí)的最低濃度即為MIC值。

3 結(jié)果與分析

3.1 植物精油與硫酸粘桿菌素對不同世代的野生型菌株的最低抑菌濃度和效價(jià)比

植物精油與硫酸粘桿菌素對不同世代野生型菌株的最低抑菌濃度測定結(jié)果見表1。從表1中可以看出，植物精油與硫酸粘桿菌素對第1代野生型大腸桿菌的最低抑菌濃度分別為2%、1.8%，效價(jià)比為1.1∶1；對第3代野生型大腸桿菌的最低抑菌濃度分別為2.1%和2.7%，效價(jià)比約為0.8∶1。植物精油與硫酸粘桿菌素對第1代野生型乳酸菌的最低抑菌濃度分別為2.2%和0.8%，效價(jià)比約為2.8∶1；植物精油與硫酸粘桿菌素對第3代野生型乳酸菌的最低抑菌濃度分別為2.2%和1.5%，效價(jià)比約為1.5∶1。

表1 植物精油與硫酸粘桿菌素對不同世代的野生型菌株的最低抑菌濃度

表2 植物精油與硫酸粘桿菌素對不同分離源菌株的最低抑菌濃度

3.2 植物精油與硫酸粘桿菌素對不同分離源的菌株的最低抑菌濃度和效價(jià)比

植物精油與硫酸粘桿菌素對不同分離源的菌株的最低抑菌濃度見表2。由表2可知，植物精油與硫酸粘桿菌素對標(biāo)準(zhǔn)型大腸桿菌的最低抑菌濃度分別為2.2%和0.1%，效價(jià)比為22∶1；對野生型大腸桿菌的最低抑菌濃度分別為2.0%和1.8%，效價(jià)比約為1.1∶1；植物精油與硫酸粘桿菌素對標(biāo)準(zhǔn)型乳酸菌的最低抑菌濃度分別為2.2%和0.08%，效價(jià)比約為28∶1；植物精油與硫酸粘桿菌素對野生型乳酸菌的最低抑菌濃度分別為2.2%和0.8%，效價(jià)比約為2.8∶1。

4 結(jié)論

綜上所述，植物精油與硫酸粘桿菌素的效價(jià)比隨著世代的不同、分離源的不同而差異較大。硫酸粘桿菌素對野生型大腸桿菌和乳酸菌的抗耐受性較弱，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，必須提高硫酸粘桿菌素的添加量才能達(dá)到一樣的抑制效果；而植物精油對野生型大腸桿菌和乳酸菌的抗耐受性較強(qiáng)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，植物精油的添加量幾乎沒有變化。對不同分離源的菌株，植物精油也表現(xiàn)的較為穩(wěn)定，而硫酸粘桿菌素則變化較大。這可能是由于植物精油中活性物質(zhì)的抑菌機(jī)理是直接作用于細(xì)菌的細(xì)胞膜，使其通透性產(chǎn)生變化，破壞其生物結(jié)構(gòu)提高細(xì)菌的敏感度，而這種抑菌方式很難產(chǎn)生耐藥性（Bouhdidetal.，2009）。因此，植物精油（智然香）作為抗生素替代品，具有很好的推廣前景。

參考文獻(xiàn)：（略）