PGE2/PGE2-R介導的RAS/ERK及PI3K/AKT信號途徑與子宮肌瘤發病機制的研究

柯小平， 李經維,2 ，李 莉,2 ，劉茗敏

前列腺素是花生四烯酸的代謝產物，PGE2(prostaglandin E2)是環氧合酶促進花生四烯酸代謝所形成的產物[1]。PGE2受體分為EP1、EP2、EP3和EP4四種亞型，介導不同的PGE2依賴性生物學效應[2]。PGE2可與跨膜G蛋白偶聯的受體EPs相互作用，并激活或阻斷胞內第二信使。研究[3]證實，子宮肌肉中會有EP1受體的表達，通過提高胞內鈣離子濃度和激活蛋白激酶C而發揮作用。研究[4]表明，子宮肌瘤的發生發展與多種生長因子有關，其中包括表皮生長因子、胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)和血小板生長因子等，這些生長因子會促進肌瘤細胞的有絲分裂及生長，其中IGF-1具有刺激子宮肌層增生功能的調節因子。活化G蛋白是G蛋白偶聯受體受體信號轉導的第一步，其中最主要的信號通路為PI3K/AKT和Ras-Raf-ERK信號通路[5]。在PI3K/AKT信號通路中，磷脂酰肌醇-3激酶(phosphoinositide 3 kinase,PI3K)作為細胞內的第二信使[6]。絲/蘇氨酸蛋白激酶B(protein kinase B,PKB/AKT)是PI3K信號轉導途徑中的一個重要的下游靶激酶。PI3K/AKT信號通路參與細胞生長、增殖、分化信號調節[7]。在Ras-Raf-ERK信號通路中，生長因子與受體結合后激活酪氨酸激酶并傳遞給Ras蛋白，Ras-GTP直接與Raf相結合激活[8]。細胞外信號調節激酶(extracellular regulated protein kinase，ERK)包括ERK1和ERK2，與細胞的增殖分化密切相關[9]。RAS/ERK及PI3K/AKT信號級聯傳導，參與調控細胞周期啟動、增殖或凋亡效應[10]。

該研究旨在探究PGE2及其受體介導的RAS/ERK和PI3K/AKT兩條細胞增殖信號途徑在子宮肌瘤發病機制方面的作用。收集子宮肌瘤和其鄰近正常平滑肌組織，Real-time PCR檢測PEG2-R(EP1)的表達，Western blot檢測PGE2和PGE2-R的表達；經PGE2-R激動劑或抑制劑預處理的子宮肌瘤細胞后，測定細胞的增殖效應，并采用Real-time PCR及Western blot檢測PGE2/PGE2-R介導的RAS/ERK途徑中和PI3K/AKT途徑信號分子Ras、ERK、PI3k、AKT、IGF-1、轉化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)及增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)等指標。探究PGE2/PGE2R介導的子宮肌瘤增殖信號及增殖效應，為子發病機制提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 病例資料選擇2014年1月～2015年1月同濟大學附屬楊浦醫院收治的腹腔鏡下行子宮肌瘤切除術的30例患者，年齡30～52(40.66±5.78)歲，近6個月內未服用激素類藥物。子宮肌瘤和平滑肌經病理學確診，無其他并發癥。選取手術切除的肌瘤組織為實驗組，肌瘤附近0.5 cm的子宮平滑肌組織(視為健康組)為對照組。經過患者同意和本院倫理委員會批準。所收集組織一部分保存于液氮中用于后續蛋白提取和RNA抽提，另一部分剪成小片，用于細胞培養。

1.2實驗試劑CCK-8試劑盒購自美國SAB公司，貨號CP002；SYBR Green PCR試劑盒購自美國Thermo公司，貨號#K0223；逆轉錄試劑盒購自立陶宛Fermentas公司，貨號#K1622；BCA蛋白定量試劑盒購自美國Thermo公司，貨號PICPI23223；RIPA組織細胞快速裂解液購自北京Solarbio公司，貨號R0010；PGE2、PGE2-R(EP1)、PCNA、TGF-β、IGF-1、p-AKT、AKT、p-ERK1/2、ERK1/2抗體和二抗均購自美國CST公司。其他試劑均為分析純。

1.3 實驗方法

1.3.1實驗分組及給藥 液氮中子宮肌瘤組織和鄰近平滑肌組織取出，RT-PCR檢測30對樣本PGE2-R(EP1)的表達，Western blot檢測PGE2和PGE2-R(EP1)的表達。培養子宮肌瘤原代細胞，同時加入PGE2-R(EP1受體)抑制劑sc-51322或激動劑17-PT-PGE2，分為原代細胞組、原代+sc-51322組和原代+17-PT-PGE2組。

1.3.2細胞培養 子宮肌瘤組織置于1%雙抗(青鏈霉素混合液)的HBSS中；0.4%膠原酶8 ml(內含DNase I)，37 ℃搖床消化；消化結束后后用含10%的DMEM-F12重懸細胞，置細胞培養瓶中，置于37 ℃、5% CO2的細胞培養箱中孵育培養。每隔20 min將沒有貼壁的細胞轉移到新的培養瓶中，重復3次，第1次貼下來的即為平滑肌細胞，經過3次貼壁仍未貼壁的細胞即為平滑肌細胞。此貼壁法是根據時間差采用的對成纖維細胞和平滑肌細胞進行的分離。24 h后健康細胞均已貼壁；48 h后貼壁細胞形成小的克隆。鑒定子宮平滑肌細胞的標準采用α-actin免疫組化染色，培養子宮肌瘤細胞同平滑肌細胞。

1.3.3CCK-8檢測子宮肌瘤原代細胞的增殖活性 將處于對數生長期的子宮肌瘤原代細胞經胰蛋白酶消化，顯微鏡下計數后制成3×104個/ml的細胞懸液。分別取100 μl至96孔培養板，每組細胞每塊板接種3個同樣的孔作為復孔，3×103個細胞/孔，以100 μl培養液做空白對照，37 ℃培養過夜。實驗分組如下：① 原代細胞：100 μl完全培養基正常培養；② 原代細胞+sc-51322：加入終濃度為10 μmol/L sc-51322(PGE2-R抑制劑)；③ 原代細胞+17-PT-PGE2：加入終濃度為5 μmol/L 17-PT-PGE2 (PGE2-R激動劑)。分別在共培養0、24、48、72 h后，按1 ∶10體積比混合細胞計數試劑盒(CCK-8)和無血清必需基本培養基，每孔400 μl 加入待測孔中，在37 ℃、5%CO2培養箱中孵育1 h；孵育1 h后，用酶標儀測定450 nm波長吸光度(absorbance,A)值，并記錄每塊板的數值。

1.3.4Real-time PCR 取子宮肌瘤組織和平滑肌組織各10 mg，TRIzol提取總RNA，將RNA逆轉錄程cDNA。設計PGE2-R引物：上游引物：5′-CACCTTCTTTGGCGGCTCTC -3′；下游引物：5′-CGACACCACCATGATACCGA-3′,擴增片段長度100 bp。以GAPDH為內參照，上游引物：5′-AATCCCATCACCATCTTC-3′；下游引物： 5′- AGGCTGTTGTCATACTTC-3′，擴增片段長度218 bp。PCR反應總體積25 μl，反應程序：95 ℃，10 min(95 ℃，15 s；60 ℃，45 s)×40；95 ℃,15 s；60 ℃,1 min；95 ℃,15 s；60 ℃,15 s。數據采用儀器自帶軟件分析(ABI Prism 7300 SDS 軟件)。

1.3.5Western blot實驗 將需要抽提蛋白的細胞或組織，加入含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的裂解液，4 ℃充分裂解細胞，95 ℃以上加熱10 min，12 000 r/min離心10 min，取上清液，進行蛋白質定量后貯存于-80 ℃ 冰箱。使用BCA蛋白濃度試劑盒對蛋白濃度進行定量。

選取5%的濃縮膠和10%的分離膠，取20 μl蛋白樣品進行上樣，電泳結束后，將蛋白轉移至PVDF膜上。麗春紅染色檢測轉膜成功。使用10%的脫脂乳粉溶液進行封閉2 h后，加入稀釋的一抗：PGE2 1 ∶300，PGE2-R 1 ∶500，PCNA 1 ∶1 000，TGF-β 1 ∶300，IGF-1 1 ∶2 000，AKT 1 ∶1 000，p-AKT 1 ∶1 000，p-ERK1/2 1 ∶1 000，ERK1/2 1 ∶1 000，GAPDH 1 ∶2 000。孵育一抗的膜用TBST洗3次，每次15 min，按照1 ∶1 000稀釋標記的二抗與膜37 ℃孵育2 h。用TBST洗滌3次，每次5 min。使用化學發光法對蛋白進行顯色。

2 結果

2.1 RT-PCR檢測30對子宮肌瘤患者和健康臨床樣本的PGE2-R(EP1)表達RT-PCR檢測30對子宮肌瘤和子宮平滑肌的結果顯示，子宮肌瘤組織的PEG2-R(EP1) mRNA的表達量為(0.004 67±0.001 37)，子宮平滑肌組織的表達量(0.001 69±0.004 64)。結果顯示：子宮肌瘤組PGE2-R(EP1)的mRNA表達量顯著高于子宮平滑肌組(P<0.01)。子宮肌瘤的發生會導致PGE2受體的基因表達量升高。

2.2 Western blot檢測4對樣本PGE2和PGE2-R(EP1)的表達如圖1和表1所示，Western blot檢測4對樣本PGE2和PGE2-R(EP1)的結果表明，子宮肌瘤組織的PGE2和PGE2-R(EP1)的蛋白表達量均顯著高于子宮平滑肌組織(P<0.01)，這與基因的檢測結果相一致。

2.3 CCK-8檢測子宮肌瘤原代細胞的增殖活性如表2所示，CCK8結果顯示，與原代細胞組比較，隨著培養時間的延長，原代+sc-51322組中的細胞增殖顯著受到抑制(P<0.01)，而原代+17-PT-PGE2組中的細胞的增殖活性顯著增加(P<0.01)，并且在培養72 h后，sc-51322對細胞增殖的抑制及17-PT-PGE2對細胞增殖的促進均達到最大值，說明子宮肌瘤原代細胞的增殖與PGE2-R的表達密切相關。

圖1 Western blot檢測4對樣本PGE2和PGE2-R(EP1)的表達

1：子宮平滑肌組1；2：子宮平滑肌組2；3：子宮平滑肌組3；4：子宮平滑肌組4；5：子宮肌瘤組1；6：子宮肌瘤組2；7：子宮肌瘤組3；8：子宮肌瘤組4

表1 Western blot檢測4對樣本PGE2和PGE2-R(EP1)的表達

與子宮平滑肌組比較：**P<0.01

2.4 RT-PCR檢測子宮肌瘤原代細胞的PCNA、TGF-β、IGF-1基因表達如表3所示，RT-PCR檢測PCNA、TGF-β、IGF-1的表達結果顯示，原代+sc-51322組中的細胞PCNA、TGF-β、IGF-1的mRNA表達量顯著低于原代細胞組，原代+17-PT-PGE2組中的細胞PCNA、TGF-β、IGF-1的mRNA表達量顯著高于原代細胞組。以上結果說明子宮肌瘤原代細胞中PCNA、TGF-β、IGF-1的mRNA表達量受到PGE2-R的調控，并會隨著PGE2-R含量的增加而上調。

2.5 Western blot檢測子宮肌瘤原代細胞相關蛋白的表達如圖2和表4所示，Western blot檢測細胞中相關蛋白的結果顯示，原代+sc-51322組中的細胞PGE2、PGE2-R(EP1)、PCNA、TGF-β、IGF-1、p-AKT和p-ERK1/2的蛋白表達量均顯著低于原代細胞組，原代+17-PT-PGE2組中的細胞PGE2、PGE2-R(EP1)、PCNA、TGF-β、IGF-1、p-AKT和p-ERK1/2的蛋白表達量均顯著高于原代細胞組，說明子宮肌瘤原代細胞中RAS/ERK及PI3K/AKT信號途徑受到PGE2及其受體PGE2-R(EP1)的調控。

表2 CCK-8檢測子宮肌瘤原代細胞的增殖活性

與原代細胞組比較：*P<0.05，**P<0.01

表3 RT-PCR檢測子宮肌瘤各組細胞PCNA、TGF-β、IGF-1基因表達

與原代細胞組比較：**P<0.01

圖2 Western blot檢測子宮肌瘤各組細胞中相關蛋白的表達

A：子宮肌瘤原代細胞；B：原代+sc-51322細胞；C：原代+17-PT-PGE2細胞

表4 Western blot檢測各組細胞中PGE2、PGE2-R(EP1)、PCNA、TGF-β、IGF-1、p-AKT、p-ERK1/2的表達

與原代細胞組比較：**P<0.01

3 討論

目前，對于子宮肌瘤的病因尚不清楚，推測其可能與卵巢內分泌功能、孕激素受體、孕激素、生長因子等因素相關[11]。本研究通過收集子宮肌瘤和正常子宮平滑肌組織，結果顯示子宮肌瘤的PGE2-R(EP1)的mRNA表達量和蛋白表達量均顯著高于正常平滑肌組織(P<0.01)。這說明子宮肌瘤的發病與組織中PGE2和PGE2-R(EP1)的基因和蛋白的含量有關聯，推測組織中PGE2和PGE2-R(EP1)的上調會促使子宮肌瘤的發生與發展。

研究[12]表明，子宮肌瘤的發生發展與多種生長因子有關，其中包括TGF-β、IGF-1和PCNA等，這些生長因子會促進肌瘤細胞的有絲分裂及生長，其中IGF-1的促進功能最為顯著。本研究以子宮肌瘤原代細胞為靶細胞，加入PGE2-R(EP1受體)抑制劑sc-51322或激動劑17-PT-PGE2，測定了細胞的增殖活性以及PCNA、TGF-β、IGF-1的基因和蛋白表達情況。本研究中，與原代細胞組比較，原代+sc-51322組中的細胞增殖顯著受到抑制(P<0.01)，說明抑制劑sc-51322的加入，抑制了PGE2-R(EP1受體)的表達，從而抑制了子宮肌瘤原代細胞的增殖活性。同時，本研究還顯示，原代+17-PT-PGE2組中的細胞的增殖活性顯著高于原代細胞組，說明激動劑17-PT-PGE2的加入激活了PGE2-R(EP1受體)的表達，從而增強了子宮肌瘤原代細胞的增殖活性。為了探究PGE2-R(EP1受體)的表達與相關生長因子分泌的關系，本研究測定了PCNA、TGF-β、IGF-1的基因及蛋白表達，結果顯示，原代+sc-51322組中的細胞PCNA、TGF-β、IGF-1的mRNA和蛋白表達量顯著低于原代細胞組，而原代+17-PT-PGE2組中的蛋白的表達量顯著高于原代細胞組。以上結果說明，子宮肌瘤細胞中PGE2-R(EP1受體)的表達與相關的生長因子的分泌呈正相關性。本研究同時顯示，子宮肌瘤組織中p-AKT和p-ERK1/2均過度表達，且p-AKT和p-ERK1/2的表達與PGE2-R(EP1受體)的調控密切相關，證實PGE2-R(EP1受體)參與了子宮肌瘤的發生與發展。

體內和體外實驗證實，PGE2和PGE2-R(EP1)參與調控了子宮肌瘤的發生與發展，并且參與調控子宮肌瘤原代細胞中RAS/ERK及PI3K/AKT信號途徑，為子宮肌瘤的發病機制提供了可靠的理論依據。