腫瘤相關巨噬細胞與hr-HPV相關宮頸癌的發生發展的相關性研究

趙秀真

（山東省菏澤市第二人民醫院 婦產科，山東 菏澤 274000）

宮頸癌是婦科的三大惡性腫瘤之一，大多數宮頸癌出現的主要病因為感染高危型人乳頭狀瘤病毒（high-risk human papillomavirus,hr-HPV）[1]。惡性腫瘤發生進展中起到主要作用的為腫瘤微環境（tumor microenvironment,TME），其中大量炎性細胞浸潤引發腫瘤相關性炎癥是導致腫瘤細胞發生的第七大標志，腫瘤相關巨噬細胞（tumor associated macrophages,TAMs）與腫瘤細胞的預后、進展、發生密切相關[2]。腫瘤相關巨噬細胞是評估惡性腫瘤預后的客觀指標之一，可從各個方面對腫瘤組織的轉移、侵襲、增殖能力產生影響。腫瘤巨噬細胞包含多個分子標記物，有研究發現，分子標記物可反映單核巨噬細胞的功能狀態。本研究探析感染高危型人乳頭狀瘤病毒（hr-HPV）相關宮頸癌的發生、進展與腫瘤相關巨噬細胞的相關性，效果滿意，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

臨床選擇2016年5月-2017年3月本院的宮頸組織標本130例。其中宮頸正常組織標本20 例，宮頸癌根治性子宮切除手術38例，宮頸冷刀錐切手術20例，宮頸環切手術26例，宮頸活檢組織6例，子宮肌瘤子宮全切手術20例。病理分期：鱗狀上皮細胞癌抗原（squamous cell carcinoma antigen,SCC）（I～IIa期）30例，宮頸上皮內瘤變（cervical intraepithelial neoplasia,CIN）II～III 期組織42例，CIN I期組織38例。排除標準：宮頸癌根治性手術前后接受化學療法、放射療法等非手術治療患者、宮頸腺癌患者、急性盆腔感染患者。患者的淋巴轉移情況、組織學分型、國際婦產聯合會（International Federation of Gynecology and Obstetrics,FIGO）分期、年齡、HPV感染狀況均來源于本院婦產科。全部患者均自愿參加本研究，經醫院倫理委員會批準同意。患者檢測HPV感染方式為第二代雜交捕獲法（hybrid capture 2,HC2），少數為HPV分型檢測結果。病理科主任醫師審核全部病理資料。

1.2 試劑

中杉金橋公司提供的免疫組織二氨基聯苯胺（diaminobenzidine,DAB）顯色試劑盒和免疫組織化學檢測試劑盒，美國Abcam提供CD163小鼠抗人單克隆抗體。

1.3 方法

組織中CD163巨噬細胞應用免疫組織化學法檢測，福爾馬林中固定組織標本，應用石蠟包埋，連續切片5 μm。脫蠟水化組織切片，置于室溫環境下混合3%的雙氧水-甲醇孵育30 min，將其內源性過氧化物酶活性除去。置于微波爐內，加入pH 6.0的檸檬酸鹽緩沖液，修復抗原15 min。在37℃用10%山羊血清封閉。1∶200的一抗稀釋液稀釋CD163小鼠抗人單克隆抗體，置于4℃冰箱內過夜。在37℃二抗和切片一同孵育30 min，DAB顯色60 s，蘇木素復染。二甲苯透明，梯度酒精脫水，風干后應用中性樹脂封片固定。冷凍切片7 μm在室溫下晾干，4℃冷丙酮固定30 min，分別予以10%的正常兔血清、3%的雙氧水封閉非特異性染色。然后滴加1∶100稀釋的兔抗小鼠CD204、兔抗小鼠CD68，37℃孵育40 min，滴加1∶400生物素化的山羊抗兔IgG工作液及1∶400辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，37℃孵育40 min，DAB顯色，鏡檢，保存圖像。

1.4 腫瘤相關巨噬細胞的分子標記物計數和表達量評分

由兩位經驗豐富的病理醫師雙盲閱片，巨噬細胞膜上表達CD163，應用低倍鏡（×100）篩選CD163樣本，CD163的表達呈現棕黃色顆粒狀，進一步分析密集區的棕黃色細胞比率，在高倍鏡下（×400）隨機選擇5個視野的巨噬細胞的平均數量，按照棕黃色細胞所占比率，評估巨噬細胞CD163的表達量（0～3分），低于5%為0分，5%～20%為1分，20%～50%為2分，超過50%為3分，高水平表達為2～3分，低水平表達為0～1分。隨機選擇橫切面5個，光鏡下隨機選擇子宮橫切面的外膜、肌層、內膜視野20個（10×20倍），對每個視野內的陽性細胞數目進行統計，檢測免疫組化陽性細胞灰度。

1.5 統計學處理分析

全部數據進行SPSS 20.0軟件系統處理分析。計量資料用均數±標準差（±s）表示，比較采用t檢驗；計數資料用例（%）表示，比較進行χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同惡性程度的宮頸癌患者的腫瘤相關巨噬細胞CD163、CD204、CD68等分子標記物的表達水平

宮頸癌 SCC（I～IIa期）的 CD163、CD204、CD68等分子標記物的表達水平顯著高于CIN II～III期、CIN I期，差異有統計學意義（P＜0.05），宮頸癌 CIN II～III期的 CD163、CD204、CD68等分子標記物的表達水平顯著高于宮頸癌CIN I期，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

2.2 不同惡性程度的宮頸癌患者發生hr-HPV感染及腫瘤轉移情況分析

宮頸癌SCC（I～IIa期）發生hr-HPV感染及腫瘤淋巴結轉移情況顯著高于CIN II～III期、CIN I期，比較差異有統計學意義（P＜0.05），宮頸癌CIN II～III期發生hr-HPV感染及腫瘤淋巴結轉移情況顯著高于宮頸癌CIN I期，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

2.3 宮頸癌不同惡性程度中巨噬細胞CD163的表達情況

CD163主要表達于巨噬細胞的細胞膜上，呈棕黃色顆粒狀，正常宮頸組織組CD163+計數均值為（5.4±0.3）,CIN I期為（39.2±2.4）,CIN II～III組為（69.5±3.6），SCC組為（133.2±5.8），隨著宮頸組織惡性進展，CD163+巨噬細胞的表達呈逐漸上升趨勢。見圖1。

表1 不同惡性程度的宮頸癌患者的腫瘤相關巨噬細胞CD163、CD204、CD68等分子標記物的表達水平（±s，%）

表1 不同惡性程度的宮頸癌患者的腫瘤相關巨噬細胞CD163、CD204、CD68等分子標記物的表達水平（±s，%）

注：t1/P1為宮頸癌SCC（I～IIa期）與CIN II～III期比較，t2/P2為宮頸癌SCC（I～IIa期）與CIN Ⅰ期比較，t3/P3為CIN II～III期與CIN I期比較。

組別 例數 CD163 CD204 CD68宮頸癌 SCC ( I～IIa 期 ) 30 135.7±11.3 145.7±10.6 134.6±11.3 CIN II～III期 42 76.5±6.5 85.6±7.9 86.7±7.6 CIN I期 38 34.6±3.2 48.7±5.4 34.5±6.2 t1/P1 28.10/0.000 27.58/0.001 21.52/0.000 t2/P2 52.64/0.000 48.99/0.000 46.51/0.000 t3/P3 35.97/0.001 24.13/0.000 33.45/0.001

表2 不同惡性程度的宮頸癌患者的發生hr-HPV感染及腫瘤轉移情況分析 例（%）

圖1 CD163+巨噬細胞在宮頸組織切片中的表達情況（×400）

3 討論

目前，較多發達國家應用巴氏檢查或常規細胞學檢查法降低宮頸癌的發病率[3]。約有99%的宮頸癌患者與人乳頭狀高危型病毒密切相關（hr-HPV）[4]。有研究發現，從最初感染人乳頭狀高危型病毒到進展為宮頸癌最少不低于8年，hr-HPV陰性的女性在5～7年內不會進展為宮頸癌[5]。研究指出半年后再次進行細胞學檢查只檢測到部分高級別宮頸鱗狀上皮病變[6]。其中約有三分之一的高級別宮頸鱗狀上皮病變持續感染最終診斷為人乳頭狀高危型病毒，人乳頭狀高危型病毒多次檢測或重復細胞學檢驗對于陰道鏡轉診率的下降效果不佳[7]。目前，臨床醫學已應用新型輔助檢查方式提高宮頸癌及其癌前病變檢查的準確性[8]。有已經發生癌變的或出現癌變趨勢的細胞核酸增生異常，在細胞形態出現變化之前已經出現了核酸變化[9]。宮頸上皮DNA非整倍體缺少可用于評估臨床預后。以往文獻發現檢測DNA倍體的陽性預測值具有一定的差異性，可能與標本的數量、標本的選擇密切相關[10]。

本研究探析感染高危型人乳頭狀瘤病毒（hr-HPV）相關宮頸癌的發生、進展與腫瘤相關巨噬細胞的相關性，結果顯示：宮頸癌SCC（I～IIa 期）的 CD163、CD204、CD68等分子標記物的表達水平顯著高于CIN II～III期、CIN I期，比較差異有統計學意義（P＜0.05），宮頸癌CIN II～III期的 CD163、CD204、CD68等分子標記物的表達水平顯著高于宮頸癌CIN I期，比較差異有統計學意義（P＜0.05）。宮頸癌SCC（I～IIa期）發生hr-HPV感染及腫瘤淋巴結轉移情況顯著高于CIN II～III期、CIN I期，比較差異有統計學意義（P＜0.05），宮頸癌 CIN II～III期的發生 hr-HPV感染及腫瘤淋巴結轉移情況顯著高于宮頸癌CIN I期，比較差異有統計學意義（P＜0.05），與Canfell等[11]的研究結果大體一致，宮頸癌由最初的感染高危型人乳頭狀瘤病毒至癌前病變、浸潤癌最少需要10～15年，說明感染高危型人乳頭狀瘤病毒僅是始動因子，腫瘤微環境中的浸潤炎性細胞、血管、基質的變化、惡性腫瘤細胞的遺傳變化等因素決定了腫瘤的生長。研究表明，感染病毒與各種腫瘤的發生密切相關，可促進趨化因子、細胞因子等炎性介質、TAMs等炎性細胞集聚至腫瘤微環境內，參與腫瘤的惡變程度[12]。感染病毒引發的慢性炎性反應會導致巨噬細胞CD163的功能活化。其表達水平隨著宮頸癌的惡性程度的進展而逐漸升高[13]。腫瘤微環境經由血管內皮生長因子C促進生成脈管，同時增強腫瘤細胞的侵襲、遷移、細胞增殖功能，同時與腫瘤微環境中的相關成纖維細胞和細胞因子發生作用，對免疫系統清除、監視腫瘤功能進行抑制[14]。同時局部浸潤的腫瘤微環境可出現各種促進腫瘤生長的細胞因子，對基質降解酶進行釋放后引發癌細胞的轉移侵襲，局部活化的宮頸癌巨噬細胞表達血管內皮生長因子C水平顯著增高[15]，形成癌細胞周圍癌性淋巴管，促進淋巴結轉移[16]。但腫瘤微環境能否作為評估宮頸癌預后的預測因子具有一定的爭議性[17]，TAMs的升高可引發淋巴管密度增高，引發淋巴結轉移，患者的生存時間顯著縮短[18]。本研究因缺少隨訪數據，研究樣本量有限，不能進一步分析巨噬細胞分子標志物CD163、CD204與宮頸癌患者的生存時間和預后進行深入分析[19-20]。

綜上所述，巨噬細胞中的CD163的表達水平與高危型人乳頭狀瘤病毒密切相關，巨噬細胞CD204、CD163、CD68的表達水平隨著宮頸癌的惡性程度而逐漸增高，高危型人乳頭狀瘤病毒引發的宮頸癌可選擇巨噬細胞CD204、CD163、CD68作為其進展發生的前瞻性預測因子。